一些分子生物学实验小技术1

1．保存菌种

保存菌种或长时间放置的培养板应先划板活化菌种，挑取分隔良好的单 克隆接种于2-10 ml ＬＢ中（如菌种含质粒则应加抗生素）３７摄氏度快摇 ８小时，按0.1%-0.5% 比例转种，培养基的量不应超过锥瓶的0.25容量，以 保证足够的通气。用O.D.600 测菌密度时，读数值在0.1-0.5 范围内为线性相关，超过该范围的应作稀释。通常１升的过夜培养12-16h，湿重为3 g左右，密度往往是3-4 ′109 个细胞／每毫升培养物离心收菌后可在-20摄氏度冻存数周。

2．T 法快速转化大肠杆菌
A．过夜培养物转种后27拚２度快摇约205hrs至O.D 值为0.3 左右。

B．取１ml菌液离心收菌，加入0.1ml 冰浴的1 ′T 液轻轻吸打悬起细胞。（可以放-70 摄氏度冻存半年）B 、可以取0.1ml 菌液加入0.1ml 冰浴的2 ′T 混匀，该方法只适于做质粒转化，如做连接产物转化请按２Ａ做。

C．加100pg-10ngDNA 混匀。冰浴10min ，室温放置10分钟再次冰浴10mi.

D．加1ml LB，37摄氏度1 小时。

E．涂板。转化效率106-108 对于DH52，Ｃ600 ，等转化效率在107-108 以上）。 快速鉴定插入外源片段的克隆
3．快速鉴定插入外源片段的克隆（从转化子中筛选重组名）

由于载体自身环化会产生大量的不含插入片段的转化子，给鉴定重组子带来一些麻烦。通常用双酶切（即插入片段两端酶切位点不同）载体去磷酸化，或者蓝白斑筛选有助于减少这种麻烦，但有的时候还是会需要大量筛选转化子中的重组子。

A．Epicertre 公司提供一种快速连接和筛选试剂盒。可在转化子分布不是太密时（较低的铺板密度）待菌长到较大时，用灭菌牙签沾很少量菌点板（转到新的筛选平板上以便给菌落编号），将剩下的菌全部挑起转至已加入快速筛选试剂的eerdorf管中，混句，补加试剂2 后即可准备上样跑电泳，鉴定是否插入外源片段。

B．转化子密度很高时可用灭菌牙莶沾取菌落，点板编号后插入含1mlLB （含抗生素）的小试管中，加盖，37摄氏度快摇3-5hrs至LB浑浊（肉眼观察很明显长菌），转至eerdorf 管中离心收菌，去上清。加入15ml含RNAse A 和溴酚蓝（溴酚蓝也可以最后上样再加）的ＴＥ，振荡以充分悬浮细胞，加入15ml酚一氯仿剧烈振荡5-10秒，离心，取上清即可上样电泳。注意这时电泳槽中buffer的量应比胶面高2mm ，上样时要小心，避免上清的扩散。胶不宜太厚。如果细菌太多加酚后振荡应为液状，如成固体状就是太多菌了）则要相应增加ＴＥ和酚氯仿量。另外，我们推荐CＬＰ公司或Ａ、Ｂ公司的电泳槽，这种电泳槽的承胶底座是透紫外的，当制胶时加入ＥＢ即可在电泳的过程中观察电泳情况。在大量筛选时往往要同时跑很多的样品，制较大的胶，在ＤＮＡ量较少的情况下往往需用短波下紫外观察以便得到更清楚的结果。用这种电泳板即可直接把承胶底座连胶一起放在下紫外灯上（或凝胶成像系统中），不需要将胶推下来或倒置。在需要时即可继续电泳。

4．当找到可能的重组质粒且条带清晰时可直接切下含DNA 的凝胶条带，用胶回收DNA 的方法回收质粒并进行酶切鉴定，如果DNA 量太少则需重提质粒。 用QIAprep Miniprep in 小量提质粒注意以下事项可提高得率
A．用含抗生素的培养基培养细菌会有较高的得率。
B．收菌时用ti吸干净残余的培养基上清。
C．加入Ｐ１后应充分振荡以完全打散悬浮细胞，特别是多次离心收菌的情况下较难打散细菌，可用ti 反复吸打因为残留的小块菌团会严重影响得率和DNA 的质量。

D．加入Ｐ２后立即轻轻摇匀，可反复倒转eerdorf 管4-6 次充分混匀菌数较多时可静置不超过5 分钟，以便充分裂解提高得率，超过5 分钟的会降低质粒质量。甚至可能出现部分质粒不可逆的变性的情况，可能在电泳时得到一条酶切不动的质粒条带。

E．加入Ｎ３后立即轻轻混匀，可反复倒转eerdorf 管5-7 次以充分混匀。菌数较多时可静置几分钟以便质粒充分复性。
F．离心后上清液上柱，注意不要将悬浮的细胞碎片（如果有的话）加入柱中，如已在柱中请吸出。我们建议一定用洗柱，特别是菌数较多，或菌株糖蛋白较多的情况，以保证DNA 的质量。
G．对于较大的质粒，（<10Kb ），请70摄氏度预热、洗脱buffer或ddH2O 以提高得率，对于拷贝数不高的情况可以用50ml洗脱buffer或ddH2O 分别洗2 次，如果拷贝数高的可用100ml.静置1 分钟后再离心，有助提高得率，buffer或H2O 应加在膜中央而非管壁上。