一文让你了解实时荧光定量pcr

　　实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

　　实时荧光定量PCR检测方法有SYBRGreenⅠ法和TaqMan探针法。

　　SYBRGreenⅠ法是在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

　　TaqMan探针法是在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

　　在对荧光定量PCR结果进行分析时首先要了解几个概念：

　　基线（Baseline）指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。

　　光域值threshold的设定，一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。

　　CT值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。

　　融解曲线是用来验证扩增产物特异性的，如果产物是单一条带，融解曲线就会出现一尖峰；如果有引物二聚体或其它非特异性扩增，就会出现至少两个尖峰。