不同平台的二代测序技术

　　二代测序技术基于大规模平行测序技术（massive parallel analysis，MPS），它能同时完成测序模板互补链的合成和序列数据的获取。主要可以分成Roche 454焦磷酸测序、Illumina Solexa合成测序和ABI SOLiD连接法测序。

　　（1）Roche 454焦磷酸测序：使用边合成边测序技术，避免了Sanger法存在的宿主菌克隆问题。即首先将目的DNA片段打断成300-800bp的小片段，然后在5’端加上一个磷酸基团，并将3’端变成平端，再在两端加上衔接子组成目的DNA的样品文库。之后将目的DNA片段固定到磁珠上，将磁珠包被在单个油水混合小滴中进行独立的扩增，从而实现所有目的DNA片段进行平行扩增PCR。随后将这些DNA放入PCT反应板中共进行后继测序，这里面包含了化学光反应所需的各种酶和底物。测序开始时，将T、A、G、C按顺序循环单分子进入PTP 板，如果发生配对，则会释放一个焦磷酸盐分子，其在后续与ATP磷酸化酶和虫荧光素反应产生光信号，此光信号被捕获以确定碱基序列。

　　（2）Illumina Solexa合成测序：使用克隆单分子阵列技术。首先将目的DNA片段打断成100-200bp，随机连接到固相基质上，经过Bst 聚合酶延伸和甲酸胺变性的桥PCR循环，生成大量的 DNA簇，之后的反应与Sanger法类似，每次延伸所产生的光信号被标准的阵列光学检测系统分析测序，下一次循环中把终止剂和荧光标记基团裂解掉，然后继续延伸 dNTP，实现了边合成边测序技术。

　　（3）ABI SOLiD连接法测序：首先制备DNA文库，可以使用片段文库和配对末端文库。第二阶段与焦磷酸测序相同，加入磁珠等反应元件进行emPCR平行扩增，，不同的是该方法的磁珠只有1 µm。在连接测序中，底物是 8 个碱基的八聚体单链荧光探针，在5′末端分别标记了CY5、Teaxs Red、CY3、6-FAM这四种颜色的荧光染料。3′ 端的第 1、2 位碱基类别排序分别对应着一个固定的荧光染料，第 3、4、5 位碱基“n”是随机碱基，第 6、7、8 位碱基“z”是可以和任何碱基配对的特殊碱基。一次测序中包括了五轮连接反应，可以减小测序误差。

　　2.5代测序——半导体测序技术，由Ion Torrent研制开发。由于使用到了Emusion PCR技术，其实质介于二代和三代测序技术之间。该技术使用一种高密度半导体芯片，每个芯片单独的进行测序。实验时先将芯片置于一个离子敏感层和离子感受器之上，当DNA聚合酶在每一个单分子模板链上滑动时，发生聚合反应，释放出氢离子，最终离子感受器就会捕捉到这种信号，从而读出DNA序列。