人外周血白细胞DNA制备

实验概要

本实验从人外周血中制备了白细胞DNA，介绍了制备基本原理及操作步骤。

实验原理

从全血制备白细胞DNA，可用非离子去污剂Triton   X-100直接破裂血中红细胞和白细胞的细胞膜，释出血红蛋白及细胞核，在反应体系中含一定浓度蔗糖，维护核膜内外的渗透压，以防止核膜破裂，通过离心等手段即可获得白细胞的细胞核。向核悬液中加入SDS破坏核膜，并使DNA从核蛋白中解离，经蛋白酶K，酚/氯仿抽提等常规制备DNA程序，即可获得白细胞DNA。Triton  X-100直接法，操作简便，经济，DNA得率高，可用于临床。

主要试剂

1. 溶液Ⅰ(pH7.6)：0.32mol/L蔗糖；5mmol/L MgCl₂；1％Triton X-100；0.01mol/L Tris-HCl (pH7.6)。

2. 溶液Ⅱ：75mmol/L NaCl；24mmol/L EDTA Na₂ (pH8.0)。

3. 10％SDS

4. 蛋白酶K：20mg/ml，-20℃贮存。

5. 1×TE (pH8.0)：10mmol/L Tris-HCl (pH8.0)；1mmol/L EDTA-Na₂ (pH8.0)。

6. 0.9％NaCl

7. TE饱和重蒸酚(pH8.0)

8. 氯仿/异戊醇混合液(24：1V/V)

9. 10mol/L NH₄AC

10. 无水乙醇(AR)，-20℃贮存。

11. 70％乙醇，-20℃贮存。

以上试剂1、2、5、6、9均需高压灭菌，4℃贮存备用。

主要设备

1. 高速冷冻机

2. 恒温水浴

3. 离心机

4. 电泳仪及电泳槽

实验材料

人外周血

实验步骤

1. 取2~5ml外周全血，加9倍体积的预冷溶液Ⅰ，振摇约5~10分钟至溶液均一透明，于4℃3000×g离心10分钟。

2. 弃上清液，沉淀加0.9％NaCl适量洗涤3000xg离心10分钟。

3. 弃上清，加5ml预冷溶液Ⅱ悬浮核沉淀，加SDS至终浓度0.5％和加蛋白酶K至终浓度为200μg/ml，混匀，65℃水浴保温5小时。

4. 加1/2体积TE(pH8.0)饱和，混匀，旋转室温3分钟，再加1/2体积的氯仿/异戊醇，颠倒塑料管，轻轻充分混匀，于600×g室温离心3分钟，溶液分出两相，用大口塑料吸头吸取上层液于一洁净离心管中，反复抽提至界面清洁。

5. 取上层液，再用等体积氯仿/异戊醇抽提1次，600×g室温离心3分钟。

6. 取上层水相，加1/3体积的10mol/L NH₄AC和2倍体积的预冷无水乙醇，充分混匀，纤维状DNA即从溶液中析出。

7. 用大口塑料吸头吸出丝状沉淀物，用70％乙醇洗涤1次，抽干，溶于适量1×TE(pH8.0)中，4℃贮存备用。

8. 电泳鉴定(见质粒DNA的限制性酶及电泳分析)。