发布时间:2020-08-24 13:07 原文链接: 人胰腺癌裸小鼠模型的建立实验

实验方法原理 将人胰腺癌细胞株8988 接种于裸鼠腋窝处皮下,每周测量肿瘤大小,第42d 处死小鼠。肿瘤组织及相关脏器送病理及电镜检查,放射免疫法检测相关抗原。皮下肿瘤组织细胞及细胞株培养,HE 染色。

实验材料 裸小鼠BALB c nu-nu胰腺癌细胞株8988

试剂、试剂盒 RPMI-1640 完全培养基胰酶戊二醛

仪器、耗材 CO2 培养箱试管

实验步骤

一、实验材料准备 


裸小鼠BALB/ c nu- nu ,4~6 周龄,体重16~20 g,雌雄兼备,SPF 级环境中饲养,恒温25~27 ℃,恒湿45%~50% ,饮用水及食物均经灭菌。

 

二、人胰腺癌细胞株8988 体外传代培养

 

1.  将人胰腺癌细胞株放入含10 %的RPMI-1640 完全培养基中,置于37 ℃、5 %CO2 培养箱中,每2d 换液1次,2~3d,0. 25 %的胰酶消化,一传3 传代培养。


2.  待细胞布满瓶底时,收集单细胞悬液,每只5 ×106 肿瘤细胞,0. 2ml ,注射于裸小鼠腋窝处皮下,建立肿瘤模型。


3.  每周用游标卡尺测量肿瘤大小,按公式V= π/ 6 ×长×宽×高,计算肿瘤大小,并绘制生长曲线。

 

三、血清学检测

 

第6 周时拔眼球法处死小鼠,收集血液于试管中,静置取血清,检测肿瘤相关抗原及淀粉酶。

 

四、巨检

 

1.  处死裸鼠后,皮下剥离肿瘤,记录质地、浸润、血供情况,观察有无腹腔粘连,各脏器转移状况。


2.  将肿瘤组织、肺、肝、脾、肠系膜、十二指肠、胃、脑等取标本置于10 %的福尔马林固定液中待用。

 

五、病理学检测

上述标本常规石蜡包埋切片,HE 染色,光镜观察。

 

六、超微结构观察

 

肿瘤组织2. 5 %戊二醛,1 %锇酸双固定,包埋,超薄切片,铀铅双重染色,透射电镜观察。

 

七、镜检

 

1.   肿瘤组织细胞培养及活细胞观察:取新鲜裸鼠皮下肿瘤组织,PBS 漂洗3 次,剪成1 m3 大小,0. 25 %的胰酶消化,去除粗大组织后,制成单细胞悬液,置37 ℃、5%CO2 培养箱中培养,倒置显微镜下观察其形态、生长情况等, 并与细胞株8988 进行比较。


2.  细胞HE 染色及形态学观察:肿瘤细胞及细胞株相同量培养于含有盖玻片的六孔板中, 生长至次融合后,弃培养基,PBS 洗3 次,2. 5 %戊二醛固定,PBS 洗3 次,HE 染色,光镜下观察比较。


其他

一、实验讨论


胰腺癌是恶性程度高、发展快、预后极差的肿瘤,早期症状不典型,至出现明显症状时,多已进入晚期,失去了根治机会。对传统的放、化疗不敏感,即使是成功地实施了手术的病人,由于术后易转移,5 年生存率仅接近20 % 。


为了研究胰腺癌的生物学特性,探讨其诊断及治疗的有效措施,建立动物模型是非常必要的。动物荷瘤模型来源一般有3 种:自发性肿瘤、诱发性肿瘤及移植性肿瘤。由于自发性肿瘤具有不确定性及不稳定性,极少单独做肿瘤模型用。肿瘤的诱发因素还不是很明确的情况下,诱发性肿瘤的成功率较低,而且所诱发的肿瘤同时存在多种组织学类型,不利于对肿瘤更精细地进行研究,小鼠先天胸腺缺乏,T 细胞不能正常分化,对来自异体的组织没有排斥作用,广泛地应用于人类肿瘤的移植,但是裸鼠并不是免疫空白动物,其成年的N K 细胞活性较高,所以皮下种植较原位移植的成功率高。


本实验采用皮下种植,肿瘤细胞的生物学特性保持完好,肿瘤组织光镜及电镜观察符合细胞株8988 原有的结构特点,形态学未见明显差异,肿瘤组织细胞培养,其形态学与细胞株8988 基本符合,动物个体间差异小,血清检测未发现肿瘤相关抗原,考虑皮下种植由于肿瘤包膜完整,局部浸润,无远程转移引起。


一般影响动物实验结果的因素有种属、年龄、体重、性别、生长环境等,本实验采用BALB/ c nu- nu 健康裸小鼠,4~6 周龄,体重控制在16~20 g ,SPF 级环境下饲养,饮用水及食物消毒后由裸鼠自由食用,基本避免了这些因素的影响,裸鼠雌雄兼备,实验中未见性别对结果有显著影响。

 

本研究结果显示,人胰腺癌细胞株8988 接种后,潜伏期短(5~7 d) ,生长良好,成功率高(95 %),且方法简单,易于操作,生物学特性保持较好。而且由于肿瘤生长在皮下,非常容易观察实验药物的疗效及肿瘤大小的变化,可用于胰腺癌药物的疗效研究。GOLD David V 等用荷人胰腺癌裸鼠做放射免疫治疗实验,取得了较好的结果。


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