人诱导性多能干细胞诱导

实验概要

人诱导性多能干细胞诱导

主要试剂

DPBS、0.25% Trypsin、1mg/mL胶原酶Ⅳ、丝裂霉素C、0.1%明胶、Polybrene、PE-TRA-1-60抗体、hESCs培养液、细胞基础培养液

• 条件培养液
  hiPSCs的诱导是一个长时间的过程，在饲养层质量下降之后，可以选择使用条件培养液。条件培养液中含有饲养层细胞所分泌的各种因子，这些因子对于ESCs或者iPSCs的生长是非常重要的。
  接种好的饲养层细胞换成hESCs培养液，第二天收集培养液，此培养液就叫条件培养液。条件培养液可以连续收集七天。用之前要用0.22 μm滤器过滤。
  

主要设备

35 mm培养皿，4孔培养板，滤器，2 mL、5 mL、10 mL、15 mL、25 mL、50 mL离心管，细胞计数仪，巴斯德管，倒置显微镜，培养箱，水浴锅，生物安全柜，体视镜

实验材料

供体细胞、4因子病毒

实验步骤

长满的人包皮成纤维细胞或者胎儿来源的成纤维细胞，按照常规的细胞传代方法，将供体细胞按2×104cells/cm2接种到12孔培养板的一个孔，24 h左右后使用，
！注意：最好选择细胞低于7代的供体细胞，以保证诱导效率。
（2）病毒进行感染
①先把培养液换成成纤维细胞培养液，再把四个因子的病毒同时加到事先接种好的供体细胞里（把每个因子20 μL病毒,共80 μL病毒加入到1 mL的成纤维细胞培养液中），同时加入Polybrene至终浓度为8 μg/mL以增加感染效率。
！注意：感染前用对照GFP进行标定，感染时根据标定的病毒滴度加入所需的病毒量。一般用不同滴度的GFP病毒感染细胞，摸索出刚好感染效率在80-100%的病毒量，如果病毒量过多，会导致被感染的供体细胞凋亡。
②培养12～19 h后更换新鲜的细胞基础培养液。
（3）hiPSCs诱导
①待被感染供体细胞增殖到70%～80%，开始准备饲养层，饲养层细胞密度同hESCs建系密度。
！注意:最好使用现做的饲养层，而不选用冻存复苏的。
②待被感染供体细胞基本长满。此时可以用0.25%Trypsin把细胞消化成单细胞，收集细胞进行计数，离心，按照1×104 cells/cm2 接种到饲养层上，仍然用细胞基础培养液
!注意：计数可采用普通的血球计数板计数或者自动细胞计数仪计数。
③第二天，弃去细胞基础培养液，换成hESCs培养液。
④观察细胞及其变化，大概7～10天后，会出现小克隆
⑤更换新鲜的hESCs培养液并观察克隆，克隆逐渐长大，13天后细胞每天都必须进行换液。
⑥14天后开始准备挑克隆，提前一天准备饲养层，可以选择用24孔培养板进行第一次挑克隆，注意要一个克隆一个孔，重编程完全的克隆可以继续培养，
！注意：挑克隆之前进行hESCs特异性的膜蛋白标志PE-TRA-1-60的活细胞染色【在不影响细胞活力的情况下，对核酸或特定蛋白的染色方法。不需对细胞进行较复杂的处理。如果针对膜染色，仅需将抗体按特定比例稀释加入到培养液中，1-2 h后观察。之后，细胞换液，继续培养。】，染色前换新鲜的培养液，按1:200的浓度加入抗体，1 h后弃去培养液，换成新鲜的培养液，荧光镜下进行观察，挑取TRA-1-60阳性的克隆进行建系
⑦供体细胞接种到饲养层后的第7天，饲养层细胞活力逐渐变小，有些开始凋亡，这个时候开始加条件培养液。
⑧挑取克隆后传代及其鉴定。