不对称PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA)。
这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50——100:1。在PCR反应的最初10——15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR 就会产生大量的单链DNA。
不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例。还有一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增，制备双键DNA，(dsDNA)，然后以此dsDNA为模板，再以其中的一条引物进行第二次PCR，制备ssDNA。不对称PCR制备的ssDNA，主要用于核酸序列测定。