试剂、试剂盒 磷酸盐缓冲液 淋巴细胞分离液 RNAzol B( Biogencsis UK） 氯仿异丙醇乙醇 氯化钠 DFPC 处理的水 离心管1.5X 溶 液 D: 6 mol L 硫氰酸胍柠檬酸钠十二烷基肌氨酸钠 2-巯基乙醇 酚 乙酸钠
仪器、耗材 离心管
实验步骤
一 材料与设备
1. 鲜血中 RNA 提取
1)磷酸盐缓冲液 (PBS)
2)淋巴细胞分离液
3)RNAzolB (Biogencsis,UK）
4)氯仿
5)异丙醇
7)乙醇
8)5mol/L 氯化钠
9）DFPC 处理的水
10）10 ml 离心管
2. 冰冻血液中 RNA 提取
1)1.5X 溶液 D:6mol/L 硫氰酸胍，37.5 mmol/L 柠檬酸钠 pH7.0,0.75% 十二烷基肌氨酸钠 H0.15mol/L2-巯基乙醇
2) 酚：氯仿（5:I，pH 约 4.0)
3)4,2mol/L 乙酸钠 pH4-0.
4) 异丙醇。
5) 乙醇。
6)30 ml 离心管
二 操作方法
1. 鲜血中 RNA 提取
1) 在 20 ml 无菌管中. 用磷酸盐缓冲液稀释抗凝全血 (2:l)10 mL
2) 小心将 10 ml 稀释的血液加人离心管中，管中含有 3m] 淋巴细胞分离液。确保血液和分离液冇十分明显的界面. 二者间应极少或没有混合。
3）室温下 400 g 离心 30〜40 min，或 800 g 离心 15 min
4) 离心后获得澄清的溶液，聚集的红细胞沉到管底，单核细胞包括淋巴细胞形成明显的云样带位于上层血浆相和下层淋巴细胞分离液的界面。用吸头将单核细胞层移至另一离心管中。
5) 加入 1XPBS 至混合均句，如步骤 3 离心。
6) 去掉上层溶液. 在该状态下，淋巴细胞可在-20℃ 储存几天。
7) 加人 0.RMAzolB 裂解细胞，反复用吸头吹打，以充分吹打以溶解细胞。
8) 移人另一无菌 Eppendorf 管中，加入 50u1 氯仿，剧烈振荡 15s，4℃ 或冰上孵育 5 min，样本可在该状态保持 1〜2 h
9)12000 g 离心 15 min
10) 将上层水相移至一个新的 Eppendorf 管，小心避免与中间相混合，该中间相含 DNA 和蛋白质。加人等体枳异丙醇约 400ul,4℃ 或 20℃ 过夜。
11)12000 g 高速离心 15mim，管底可见:RNA 沉淀。
12) 移去上清液，加入 800ul75% 乙醉冼涤 RMA 沉淀一次，7500 g 离心 8 min。
13) 加人 200ul0.2mol/L 氯化钠再溶解 RNA。用 400ul100% 乙醇沉淀 RNA，一 20℃ 放置 lh
14)12000 g 高速离心 15 mm,RNA 沉淀用乙醇洗涤同上
15) 打开管 L1，室温干燥 15 min
16) 加人 50〜100ulDEPC 处理的水，溶解 RNA, 为增加溶解度，可在 52〜60℃ 助溶 5〜I5 min
17) 定量分析 RNA
2. 冰冻血液中 R1NA 提取
1) 水浴加热 2 ml(或 5 ml) 的冰冻全血
2) 标本充分融化后，将其移人无菌的 30 ml 离心管中，内含 3 ml(或 5 ml)1.5XD 溶液，混合均匀。加人 6 ml(或 1Oml) 酚：氯仿（5:1) 和 0.5 ml（或 1 ml)4.2mol/L 乙酸钠，PH4.0, 混合均勻，混合时最好用封口膜封口。
3) 冰上孵育 20mim。
4)5500 g，4℃ 离心 30 min
5）转移上清液至另一离心管中
6) 加人等体积的异内醇，一 20℃ 过夜。
7)5500 g 离心 30 min
8) 弃上清液，将管倒置 2〜3 min
9) 加入 300ul1.5X 溶液 D 溶解沉淀。如需要再加入 400ul 异丙醇,—20℃ 放置 lh
10) 室温下 11000 g 离心 lOmin
11) 弃上清液，加人 750ul75% 乙醇洗涤沉淀，11000 g 离心 2 min
12) 弃上清液，加人 50ulDEPC 处理水溶解 RNA
13) 定量分析 RNA
注意事项
1)RNAzolB 含有硫氰酸胍，该物质有刺激性，因此建议在通风橱中处理硫氰酸胍。
2) 合适的抗凝剂是 3.8% 柠檬酸钠，1:10 稀释人全血。肝素可能干扰反转录和 PCR。
3) 中间相可能非常弥散而看不到水相。遇此情况，可将标本放置，直到中间相沉积 (若需要，可以过夜)