实验材料 | 汇合至一定程度的受体细胞 |
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试剂、试剂盒 | 受体细胞适合生存的培养基 合适的选择性试剂 含感兴趣染色体及合适遗传标记的供体细胞 |
仪器、耗材 | 10 cm 组织培养板 25 cm 组织培养瓶 倒置相差显微镜 |
实验步骤 |
基本方案 单层全细胞融合
1.倘若不知道细胞的选择条件,通过以下方式来确定:将培养于 25 cm 培养瓶中的受体细胞传代,比例为 10:1,分装于不同培养瓶中,并用不同水平的选择试剂来培养。
每周 2 次观察细胞,换液,10d 之后确定抑制细胞生长的试剂的最低浓度。
2.在融合前的当天下午,将等量的供体细胞和受体细胞(通常为 5X105?IXlO6 个) 培养于含 IOml 有血清的培养基中,同时分别将供体细胞和受体细胞培养于含或不含 PEG 的培养基来做对照,培养过夜。
供体和受体细胞在选择条件下需死亡,含 PEG 的细胞应该在选择条件下恢复并开始汇合,当一个新细胞系或新的 PEG 使用时,后者的对照需重故。
3.在显微镜下观察细胞,其需 70% 汇合,细胞与细胞之间需接触良好,但互不挤压,若细胞量不够,准备新培养瓶增加培养。
4.将瓶中的培养基吸出,用无血清的培基洗 2 次,并完全将其吸出,将瓶倾斜一段时间同时将最后的培养基吸出。
5.加 2 ml50%PEG 溶液,37°C。将培养瓶来回倾斜使溶液在细胞中快速混匀,让其站立 2 min(时间非常重要),若有必要,通过以下试验来优化条件:peg 浓度为 44%~50%; 单层细胞孵育 2~3 min, 悬浮细胞 2~4 min。
6.将 10 ml 无血清培基轻柔地从皿的一边加人,轻柔颠倒使 PEG 扩散完全,吸出培基并弃去,用无血清培养基重复洗两次,最后一次用 10 ml 有血清培养基洗,由于细胞膜此时非常脆弱,故以上操作均需轻柔。
7.加人 10 ml 有血清培养基,孵育 36~48 h(在该时间段内使细胞扩增 2 次)。
8.用胰酶消化细胞,将其分至 5~10 个 10 cm 培养板中。为了确保选择,板中的细胞浓度需低,以保证细胞在汇合之前能分裂几次。在每个板中加入 10 ml 有血清培养基和合适浓度的选择性试剂(第 1 步),在 37°C 中孵育。
9.每 5d 换一次液直至长出克隆,换了选择性培基后 10?14d 后确认皿中是否有克隆长出。避免损坏细胞或使其长得越来越大,因为移动细胞可能使其长出姐妹克隆。
10.用挑克隆的针将克隆挑出(支持方案 1)。
11.为了避免维持和扩增不需要的细胞系,一旦克隆长出,立即扩增、鉴定(第 3~5 步)及冻存(附录 31)。为避免染色体缺失和重组,传代需少(三代以内细胞使用一个冻存管,1 个 6 cm 培养皿使用 2 个冻存管)。在鉴定细胞系时,需使用多种鉴定方法,在复苏和扩增时需重新鉴定以确保无染色体重组和分离。若有必要,对已分离出额外染色体的细胞系挑亚克隆(支持方案 2)12. 在快速复苏时,将细胞培养至 25 cm 组织培养瓶中,若细胞在冻存后恢复较慢,则增加冻存培养基中的血清含量。
备选方案 悬浮培养供体细胞-单层的供体细胞的全细胞融合
1.消化贴壁生长的受体细胞,在培基中重悬,用血细胞计数器对供体细胞和受体细胞计数,分别取 2XIO 6 个,在 15 ml 扣盖的聚丙烯试管中混勻,维持以确保选择有效。
2.室温 400 g 离心 5 min,在受体细胞中加入 IOml 无血清的培基,再次离心,小心吸出培养基,将试管倾斜以吸干培养基。
3.轻弹试管使团块松散。用移液器吸取 0.3 ml 50% PEG 溶液,37°C,沿管壁加人同时轻摇或轻弹试混勻。室温孵育 3 min。如有必要,可以优化融合条件(基本方案,第 5 步)
4.加入 8 ml 无血清培养基,立即 400g 离心 5 min。
5.小心吸出培养基,再用 IOml 无血清培养基重悬细胞。再次离心。室温下,吸出培养基,用 IOml 血清培养基重悬细胞。洗的过程中要格外小心,因为此时细胞的膜很脆弱。
6.加 3 ml 细胞悬液到每个 IOOmm 组织培养板内。加 ImI 细胞悬液到另一 100 mm 培养板内,作为对照。孵育 36~48 h。
7.用加血清和筛选因子的培养基培养细胞(用未加筛选因子作对照)。
8.准备克隆及其鉴定(基本方案,第 9~12 步)
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