免疫沉淀实验——基本方案

蛋白质

裂解缓冲液稀释缓冲液SDSTrisTSA

转子离心机

1.  表面标记或生物合成标记的细胞在裂解缓冲液中于4℃放置1 h 后，再于4℃3 000 g 离心10 min 除去细胞核，然后将所得上清在10000 g 离心1 min。

2.  一次性对上清进行预处理，每200 μl 上清加入10 μl 活化后被淬灭的琼脂糖对照。在旋转揺床中室温揺荡2 h 或在4℃过夜。200 g 离心1 min，保留上清。

3.  在1.5 ml 的微量离心管中加满裂解液室温作用10 min，对其进行预包被。吸去液体后，加入10⁵~10⁶ cpm 的含抗原的放射性标记上清，加稀释缓冲液使终体积为200 μl。

4.  加入10 μl 1：1的抗体-Sepharose偶联物胶浆/稀释缓冲液。4℃在旋转摇床中摇荡1. 5~3 h，一直保持Sepharose呈混悬状。

5.  Sepharose偶联物依次用1 ml 下面列出的缓冲液洗涤。毎次洗完后，200 g 离心5 min 或微量离心5 s。以细头的巴斯德吸管小心吸去上清，仅在沉淀的上面留10 μl 的液体。在第4次洗涤后，离心甩下管壁所有残余液滴并将其吸去，沉淀上仅留下约 10 μl。

6.   加入20~50 μl SDS样品缓冲液。由于样品缓冲液比重大于洗涤缓冲液，它可渗透到Sepharose中，不要用旋涡混合器旋起SEpharose，以免使之粘附在缓冲液液面以上的管壁。盖紧盖子，于100℃保温5 min。

7.  用旋涡混合器混匀，200 g 离心或微量离心5 s。将上清加样于凝胶以SDS-PAGE分析，使用增感屏进行放射自显影或荧光自显影或检测标记蛋白质。

图一、用于分离蛋白质的抗原的免疫沉淀