免疫沉淀

免疫沉淀是利用特异性抗体识别并分离抗原的方法。

材料：

上样buffer的配方(用前现配):

2ul        1.25M Tris-HCL , pH 6.8

35ul       distilled water

2.5ul       2-mercaptoethanol

12.5ul      10%SDS

10ul       80% glycerol

2ul        bromphenol blue

TNE buffer:

10mM Tris-HCl pH 8.0

10mM NaCl

0.5mM EDTA

方法：

1．用含有1% NP40的缓冲液重悬细胞，充分振荡。

2．在冰上孵育30分钟或37℃孵育10—15分钟

3．转入eppendorf管中离心3分钟

4．将上清轻轻倒入一干净试管，加入40—50 ul抗血清

5．冰上孵育2小时或4℃过夜

6．在TNE中加入100ul SPA 和100ul 5% BSA

7．冰上孵育2小时

8．离心使免疫复合物成球，用1ml含1%NP40,0.5% Na deoxychloate, 0.1% SDS 的TNE,在用超声波重悬

9．加入70ul的上样缓冲液，振荡。

10．热水中水浴90秒，离心1分钟，保留上清。

11．若不立即实验请低温保存。

（以上资料仅供参考）

免疫细胞化学：

1．在无菌消毒的6孔板中加入100，000个/孔细胞，过夜

2．倒掉上清，用PBS洗涤一次后立即加入-20°C的甲醇（注意不要让细胞干掉），再将板置于-20°C冰箱5分钟，然后倒掉甲醇加入PHEM 缓冲液，置于4°C。

3．加入含合适血清（2.5—5%）的PHEM 缓冲液轻微振摇一小时

4．加入一抗至封板缓冲液，轻微振摇孵育一小时

5．倒掉封板液，加入PHEM 缓冲液洗涤4次，每次10分钟

6．加入二抗至封板缓冲液，轻微振摇孵育半小时

7．倒掉封板液，加入PHEM 缓冲液洗涤4次，每次10分钟

8．用镊子夹起 coverslip，轻轻去除过多的缓冲液，加入约20ul“antifade”, 轻轻盖上coverslip, 去掉过多的”antifade” 后置于-20°C避光保存。

试剂配方：

PHEM 缓冲液：:

25 mM HEPES

10 mM EGTA

60 mM PIPES

2 mM MgCl₂

pH = 6.9

（请以此顺序加入）

Antifade: 1 ml

1 mg p-phenylene diamine hydrochloride 溶解在 0.1 ml 10x PBS (20 min 室温)

加入 0.9 ml 100% 甘油，封闭保存不要振摇。

若颜色变成棕色，请不要用了。分装保存在-70 °C