酶标记抗体
荧光素标记抗体技术
125I标记单克隆抗体技术
实验方法原理 | 酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否,因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是酶标记抗体,它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体,其次要有良好的制备方法。目前,高质量的酶(如辣根过氧化物酶,简称HRP)国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上,宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。 |
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实验材料 | 抗体 |
试剂、试剂盒 | 戊二醛液 萘氏试剂 PBS NaIO4 碳酸盐缓冲液 醋酸钠缓冲液 NaBH4 |
仪器、耗材 | 搅拌器 分光光度计 离心机 透析袋 烧杯 试管 吸管 |
实验步骤 |
一、酶制剂及其底物 HRP DH2+H2O2────→D+2H2O (1)原理 (2)标记步骤 ①称取HRP25 mg溶于1.25 %戊二醛溶液中,于室温静置过夜。 ⑦3000 rpm离心半小时,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15 M PH7.4的PBS中。 ①定性及效价滴定 ②定量和克分子比值测定:可用分光光度计测定(光程1 cm)。 酶量(mg/ml)=OD403 nm×0.4 IgG量(mg/ml)=OD280 nm-OD403 nm×0.42×0.94×0.62 酶量(mg/ml) IgG量(mg/ml) 酶量 克分子比值=──────── ÷ ─────── = ─── × 4 40000 160000 IgG量 ③本法标记步骤比较简单,重复性好。缺点是酶的利用率低,一般只有2~4 %的酶与蛋白质结合。 2. 简易过碘酸钠法 ①称取5 mgHRP溶解于1 ml蒸馏水中。 除标记物IgG量的计算,略有不同以外,其余均同戊二醛法。
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注意事项 |
1. 在具备高质量HRP的条件下,所要标记的抗体也要活性高,效价高(最低1∶16),纯度高,亲和力好,这是保证标记物效价高,免疫活性好的首要条件。 2. 所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂,最好(或必需)新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品,因戊二醛储存过久可形成缩和体(杂质)。否则,影响标记效果。
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其他 |
一、工作浓度的选择
4. 有关试验的试剂及器材均见ELISA部分。
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