免疫组化的操作步骤

一 免疫组化（SP法）操作步骤
1． 切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行
2.缓冲液洗 3min/2 次。
3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。
4. 缓冲液洗 5min/2 次。
5. 滴加 Ultra V Block ， 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。
（注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略。）
6. 缓冲液洗 5min/2 次。
7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）
8. 缓冲液洗 5min/2 次。
9 ． 滴加 Primary Antibody Enhancer（增强子），在室温下孵育 20 分钟。
10 ．缓冲液洗 5min/2 次。
11 ．滴加 HRP Polymer（酶标二抗） ，在室温下孵育 30 分钟。
（注：HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。）
12 ．缓冲液洗 5min/2 次。
13 ．向 1ml DAB Plus Substrate （或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen），混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。（具体时间由染色深浅决定。）
14 ．自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。 ⑴、石蜡切片脱蜡至水。
⑵、 3%H 2 O2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
⑶、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。
⑷、 5-10% 正常山羊血清（PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小时或 4 ℃ 过夜。
⑸、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
⑹、滴加适量 生物素标记二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。
⑺、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
⑻、滴加适量的 辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。
⑼、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
⑽、显色剂显色 3-15 分钟（DAB 或 NBT/BCIP）
⑾、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。 冰冻切片 4-8μm ，室温放置 30 分钟后，入 4 ℃丙酮固定 10分钟，PBS洗，5分钟x3，用过氧化氢孵育5-10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。