三、ICC在细胞功能研究中的应用
形态学研究目的之一是揭示组织细胞结构特征及其功能意义。利用ICC显示给与细胞增殖标记物，是组织细胞学研究中形态和功能相结合的重要手段之一。目前常用的细胞增殖标记物有4种，Brdu (5—bromo—2--deoxyuridine), DNA polymerase α,PCNA （Proliferating cell nuclear antigen）,Ki—67 等，相对应的4种单克隆抗体均有商品出售。因组织细胞内无内源性Brdu存在，所以Brdu应用较广。Brdu为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。
笔者在观察大鼠小肠上皮细胞增殖、代谢时，一次腹腔注射Brdu（Sigma）4mg/150～200g体重，分别在给药后1h和1、2、3、5、7天取小肠，应用抗Brdu抗体，ICC染色，可见肠上皮细胞从肠腺至绒毛顶端增生移行。在计数免疫活性细胞研究中，一次注射Brdu后，计数瞬间进入S期细胞数或连续多次注射Brdu，计数注射Brdu期间进入S期细胞的总和。另外在临床上，术前或术中给与Brdu，判断脑肿瘤细胞分化程度、恶性度等亦较常用。
掺入双链DNA内的Brdu，以氢链与腺嘌呤结合，不能直接与抗Brdu抗体反应，需经解链使Brdu暴露方能被染色。常用的解链方法为盐酸加热、蛋白酶处理等，使DNA双链部分单链化，抗Brdu小鼠单克隆抗体与增殖细胞核内的Brdu结合，再经酶标抗小鼠IgG抗体孵育、呈色，显示进入S期细胞的情况。
盐酸和蛋白酶处理等可引起其它抗原或组织形态发生变化。为此，Conchoroff(1985)等制备了一种单克隆抗体（Bu—1），其培养液上清能与双链DNA的Brdu反应，因为培养液上清中含有DNA酶，可分解双链DNA，显露Brdu，达到染色目的。笔者采用戊二醛固定后，胃蛋白酶—盐酸处理，亦得到了良好的染色结果。简述染色步骤如下（Matsuna,1989）：
（1）冰冻切片/石蜡切片准备同前。
（2）TBS冲洗，Baker’s液固定10min，室温。
（3）TBS冲洗，1%戊二醛固定5～10min，室温。
（4）双蒸水冲洗，0.006%(冰冻切片)或0.02%(石蜡切片)胃蛋白酶/0.01mol/l HCl,37℃，10min。
（5）双蒸水冲洗，4N HCl 30min，室温。
（6）PBS充分冲洗，使切片pH回至中性。
（7）封闭性阻断剂20min，室温。
（8）抗Brdu抗体孵育1～2h室温或4℃过夜。
（9）PBS冲洗，HRP标记抗小鼠IgG抗体45min，室温。
（10）PBS冲洗，DAB/H2O2呈色。
（11）轻度苏木精复染，脱水透明，封片同前。分裂增殖细胞核呈棕褐色。
采用双重或多重染色、观察何种细胞分裂增殖时，首先应染色其它抗原物质，最后显示Brdu。通常在第一种抗体呈色后，再经1%戊二醛固定5～10min，重复上述程序，均可获得较满意的染色结果，分裂细胞核呈棕褐色；显示其它抗原用ALP标记抗体，则细胞浆为红色（FR）或蓝色（FB）。
四、 ICC在原位杂交技术中的应用
传统的ICC法主要用于检测组织细胞中含有何种物质，根据该物质的作用，推测其组织细胞生理、病理意义。但该物质来自何处，是否是阳性细胞合成往往较难判断，结合免疫电镜及双重染色等方法，在某种程度上，有助于推断该物质的来源。然而通常ICC法显示的是组织细胞已经合成的物质（过去时），本身不能说明阳性组织细胞目前的功能状态，亦无法预测细胞将合成何种物质，发挥什么功能，因此，单纯的ICC法存在着被动性。
近年来，ICC法与原位杂交技术结合，使细胞内活性DNA可视化，直接显示某染色体上，何种基因活性化或非活性化，描述组织细胞现在的状态，同时亦可预知未来组织细胞将合成何种物质，发挥哪些功能等，直接观察组织细胞的时空改变，这在病理生理研究中有着重要意义，为形态学研究开辟了令人瞩目的前景。
众所周知，机体内不同的蛋白质发挥其特定的功能，与其氨基酸序列密切相关，而它的氨基酸序列又是DNA通过mRNA转录控制的。因此检测该DAN/mRNA的分布，可判断组织细胞的功能状态。为在组织细胞水平检测DNA/mRNA等一定碱基序列的核酸存在与否，Gall（1969）等建立了原位杂交方法（详见第二十章 ）。
在检测某种特定的蛋白质在哪一类细胞内合成时，常常应用连续切片或镜影切片，原位杂交法显示合成该蛋白质的mRNA，ICC法染色其蛋白质抗原，二者存在于同一细胞时，具有较强的说服力。同一切片进行上述双重染色时，原位杂交步骤中，大多数抗原物质的抗原性往往易被破坏，所以最好在ICC染色后再进行原位杂交染色。ICC染色中，抗体内含有RNase等可能破坏细胞内的mRNA，为此应选用精制IgG抗体，并加入500u/ml肝素抑制RNase。肝素系酸性多糖，其化学性质与核酸类似，能够与以核酸为底物的酶（RNase）结合，从而保护mRNA免受破坏。另外，ICC染色以DAB呈色时，核酸探针易吸附于DAB产物上，需注意。
近年随着细胞工程的进步，ICC、原位杂交技术将在细胞生物学、组织学、遗传学、病毒学、临床疾病诊断等各个领域，得到更广泛地应用。
参考文献
1.Bigbee JW,et al . Effects of primary antiserum dilution on staining of antlgen rich tissue with the peroxidase antiperoxidase technique. j Histochem Cytochem. 1977；25：433～447
2.Borrsma DM. Preparation of HRP Iabelled antibodies。In Cuello AC(ed) lmmunohistochemistry, John Wiley&,Sons, New York ：Bris－bane Toronto Singapore, 1983：87～100
3.Conchoroff NJ, et al . A monoclonal antibody reactive with 5—Boromo—2 deoxyuridine that does not requireDNA denaturation。Cytometry,1985；6t506～512
4.Costa M, et al. Immunohistochemical localization of polypeptides in peripheral autononic nerves using whole mount preparation, Histo－chemistry, 1980；65：157～165
5.Cumming R. Cyclic nucleotide losses during tissue processing for immunohistochemistry。j HistochemCotychem, 1980j28：54～55
6.Gall JG, Paudue M. Formation and detection of RNA—DNa hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natu Acad Sci USA, 1969：63,378～383
7.Grzanna R, Light microscopic immunocytochemistry with fixed unembedded tissue, In Bullock GR&Petrusz P·(eds.)Techniques in immunocytochemistry. London：Academic Press inc, 1982；1：183～204
8.Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined speciflcity, Nature,1975；256：495～497
9.Imagawa M, et al. Characteristic and evaluation of antibody horseradish peroxidase conjugates prepared by using maleimide compound,glutaraldehyde and periodate. J Biochem, 1982 j 4：41～57
10.Li CY, et al. Use of azide and hydroRen peroxide as an inhibitor for endogenous peroxidase in the immunoperoxidase method , J Histochem Cytochem, 1987；35： 1457～1640
11. Matsuno K, et al. Splenic outer periarterial lymphoid sheath (PALS)：An immunoproliferative microen- vironment constituted by antigen laden marginal metallophils and ED3 positive macrophages in the rat. Cell Tissue Res, 1989；257：459～470
12.Nakane PK, Pierce GB. Enzyme labelled antibodies：Preparation and application for the localization of antigens。j Histochem Cytochem, 1966；14：929～931
13.Norrden SV, Polak JM. Immunocytochemistry today techniques and practice, In Polak JM&Norrden SV(eds.) Immunocytdchemistry. London：Wright PSG Bristol, 1983：11～42
14. Oi VT, Herzenberg LA. Imrnunoglobulin producing hybrid cell lines. In Mishell BB and Shiigi SM, (eds.) Selected methods in cellular immunology, San Francisco：Freeman WH and Company, 1980：351～375
15. Sato Y, et al . The AMeX method. A simplified technique of tissue processing and paraffin embedding with improved preservation of antigens for immunostaining. Am J Pathol, 1986；125：431～435
16.Shi SR, et al . Antigen retrieval in forrnalin fixed,paraffin embedded tissue：An enhancement method for immunohisotchemical staining based on microwave oven heating of tissue sections 。j Histochem Cytochem, 1991；39：741～748
17.Sternberger LA, et al . The unlabelled antibody enzyme method of immunohistochemistry. Preparation and properties of soluble antigen –antigody complex (horseradish peroxidse antihorseradish peroxidase ) and its use in the identification spirochetes, J Hsitochem Cytochem, 1970；18：315～333
18. Sternberger LA, Immunocytochemistry。New York：John Wiley&Sons, 1979
19.Sternberger LA, Conjugated antibody method. In ：Sternberger LA(ed) Immunocytochemistry。3rd edi—tion, New Yor ：John Wiley&Sons, 1986
20. Vacca LL. Double bridge technique of immunocytochemistry.In：Bullock GR&Petrusz P. (eds,) Tech. niques in Immunocytochemistry. London：Academic Press inc, 1982；1：155～182
21. Yasuda K, et al. Application of ultrasound for fixation：Combined use with microwave to enhance the effect of chemical fixation. Acta Histochem Cytochem, 1992；25： 237～244
22. Zhou DS, Komuro T. Interstitial cells associated with the deep muscular plexus of the guinea—pig small intestine, with special reference to the interstitial cells of Cajal. Cell Tissue Res, 1992；268： 205～216