五、操作步骤：
（一）、模板制备
1、M13 单链模板制备：在转化入合适的大肠杆菌宿主菌且在含有指示剂如X-gal/IPTG
的培养基上铺板之后, 含有M13
重组子的细胞将表现出无色的"噬菌斑"，事实上受感染的细胞并非被噬菌体溶菌或杀死，出现噬菌斑是因为被感染的细菌在生长速度上比其周围未感染的细菌慢的缘故,
从无色噬菌斑上得到的感染细胞经培养便能产生测序反应所需的单链模板。
（1）过夜培养的宿主细胞(如NM522 或JM101)用3ml TYP 肉汁培养基以1:100 稀释。在37℃强烈震荡1 小时之后, 细胞进入对数早期。此时, 将一个合适的含有重组M13 的噬菌斑(连同琼脂)用滴管转入该细胞培养液中。
（2）37℃强烈震荡(300rpm) 培养6 小时。
（3）把细胞培养液转入两只1.5ml eppendorf 管, 12000g 离心15 分钟。上清液转移到新的eppendorf 管再离心15 分钟。小心地取出1-1.2ml 上清液(注意不能触及沉淀), 再转到新的eppendorf管。.
（4）将0.25
体积的含20％PEG(-8000)的3.75M 醋酸铵(pH7.5)加入上清液以沉淀噬菌体。混匀后置冰上30 分钟, 再以12000g
离心15 分钟, 倾去上清液, 再以同样方法离心一次, 用吸液器尖头将残留的PEG 充分吸干净。此时应能见管底有芝麻大小的噬菌体颗粒沉淀。
（5）将沉淀物重溶于400ml TE 缓冲液中。
（6）加等体积氯仿/异戊醇(24:1)混合液, 强烈震荡1 分钟，12000g 离心5 分钟。
（7）将水相转入一新的eppendorf 管, 注意不能触动原管中两相交界面。加等体积苯酚/氯仿(1:1)混合液, 强烈振荡1 分钟, 12000g 离心5 分钟。
（8）将上层水相转入另一新的eppendorf 管, 重复第7 步的提取, 如有必要重复多次直至二相之间无可见物质存在。
（9）将上层水相转入一新的eppendorf 管, 加等体积氯仿, 强烈振荡1 分钟后, 12000g 离心5分钟, 多次重复此步骤。
（10）将上层水相转入新的eppendorf 管, 加0.5 倍体积的7.5 mol/L 醋酸铵, 2 倍体积乙醇, 混匀后-20℃放置30 分钟。
（11）12000g 离心15 分钟, 去除上清液, 用70％乙醇小心清洗沉淀, 如果沉淀已被搅起, 重新离心, 倾去酒精, 真空干燥沉淀物。
（12）将DNA 的沉淀物溶解于20ml 去离子水中，取2ml 样品进行琼脂糖凝胶电泳定量, 如果DNA 量充足, 则可进行退火测序。
2、噬粒(Phagemid)单链模板的制备：
噬粒是指含有丝状单链DNA 噬菌体复制区的嵌合质粒。分子克隆中常用的pBluescript 系列和pGEM系列的质粒均属噬粒。含重组噬粒的细胞单菌落经液体培养并用辅助噬菌体超感染后就能产生测序反应所需的单链DNA 模板。
（1）从新鲜平板上挑得含pGEM 质粒DNA 的抗Amp 单菌落, 并接种到100ml 含有50mg/ml氨苄的TYP 肉汤培养基中, 在37℃振荡过夜。
（2）取100ml 过夜培养物接种到另一新的装有5ml 含50mg/mlAmp 的TYP 肉汁培养基的试管中, 在37℃强烈振荡30 分钟。
（3）加40μl 辅助噬菌体R408 或M13 K07, 继续剧烈搅拌振荡培养6-8 小时，使辅助噬菌体超感染。
（4）12000g 离心15 分钟后，去除沉淀，取上清，转移到一新eppendorf 管中再次离心15分钟, 小心地取1-1.2ml 上清液(注意不能触及沉淀)。
（5）将0.25
体积的含20％ PEG-的3.75M 醋酸铵加入上清液以沉淀噬菌体颗粒。混匀后置冰上30 分钟, 再以12000g 离心15 分钟,
倾去上清液, 再以同样方法离心一次, 用移液器尖头将残留的PEG 溶液吸净。此时应能看到管底有芝麻大小的噬菌体颗粒沉淀。
（6）将沉淀物溶解于400ml TE 缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA)。
（7）加等体积氯仿/异戊醇(24:1)混合液, 强烈振荡1 分钟, 再以12000g 离心5 分钟。
（8）将水相转入一干净eppendorf 管(不要触动原管中两相交界面), 加等体积酚/氯仿(1:1)混合液, 强烈振荡1 分钟, 12000g 离心5 分钟。
（9）上层水相转入一干净eppendorf 管重复第8 步骤提取, 如有必要重复多次直至二相之间无可见物质。
（10）将上层水相转入一干净eppendorf 管加等体积氯仿, 强烈振荡1 分钟后离心, 多次重复此步骤。
（11）将上层水相转入一干净eppendorf 管加0.5 倍体积7.5mol/L pH7.5 醋酸铵, 再加2 倍体积乙醇, 混和后-20℃放置30 分钟。
（12）12000g 离心15 分钟, 去除上清液, 用70％乙醇小心清洗沉淀, 如沉淀已被搅起,重新离心, 倾去乙醇, 真空干燥沉淀。
（13）将沉淀物溶解于20ml 去离子水中, 取2ml 样品进行琼脂糖凝胶电泳进行定量，如果DNA量充足，则进行退火和测序。
3、质粒膜板制备：参照第一章所述的方法。
（二）超螺旋质粒DNA 的碱变性：
1、取4mg（约2pmol）超螺旋质粒DNA 至一eppendorf 管中，加无离子水到终体积18ml。
2、加2ml 2mmol/L NaOH/2mmol/L EDTA 溶液, 置于室温(25℃下）保温5 分钟。
3、加2ml 2mol/L NaAc 溶液(pH4.6)涡旋混匀，使之中和。
4、加75ml 无水乙醇，充分混匀后，置于干冰或-70℃沉淀10 分钟。
5、于12000g 离心10 分钟，弃去上清，用200ml 预冷的70%乙醇洗沉淀后，干燥沉淀，溶于20ml 无离子水中。
（三）、测序反应：
1、引物和模板的退火：
（1）在一离心管中，混合如下几种试剂：引物约1-2pmol
5×T7 DNA 聚合酶测序反应缓冲液2ml
DNA 约1mg
加ddH2O 终体积至10ml 。
（2）将试管盖盖上后，65℃
加热2 分钟，然后在大约30
分钟左右的时间内，使试管的温度缓慢地降到室温。降温的过程中可使用小的加热板或小型的保温仪，也可使用已调至65℃的水浴，使它们的温度在室温下缓慢地降至室温即可。当温度降至30℃以下时，退火结束。可将小试管置于冰上，退火完毕的模板须在4
小时内使用。
2、标记反应
（1）在一个标准的反应过程中（从引物处开始，可读到500 个碱基以上），首先需要按1:5
稀释标记混合物。如4ml 混合物则加双蒸无离子水16ml。该稀释液储存在-20℃可使用数周。如果所要测定的序列小于30
个碱基，可将标记缓冲液稀释15 倍，同时，模板DNA
要高于0.5pmol。由于DNA模板量的不足，会降低标记反应的程度，即只标记引物后的几个核苷酸。
（2）用冰预冷的TE 缓冲液按1:8 稀释T7 DNA 聚合酶。酶液稀释后应立即使用，置于冰浴不宜超过60 分钟。不得使用标记混合物、DTT 溶液或非缓冲液类溶液稀释酶液。
（3）在已退火的引物-模板混合物中，依次加入：
0.1mol/L DTT 1.0ml
标记混合物2.0ml
[a-35P]dATP 或[a-35S]dATP 0.5ml
已稀释好的T7 DNA 聚合酶2.0ml
混合充分（注意不得产生气泡），置于室温5-10 分钟。
如果在电泳时碰到带压缩问题，则dITP 混合物的效果优于dGTP 混合物，dITP 混合物的使用方
法与dGTP 混合物的使用是相似的。
[注意] 1、稀释时应将所有的溶液预先混合完全后再加入酶液。
2、在第（3）步的过程中，如果反应中有几次冷却，保温的时间过长或温度太高的话，则会使测序反应短于100 个碱基。
3、链终止反应：
（1）取4 支eppendorf 管分别标上G，A，T，C。
（2）每个管分别加入2.5ml G，A，T，C 链末端终止混合物，立即盖上盖子以防液体蒸发（本反应最好在标记反应前做好）。dGTP 和dITP 混合物依据各自需要选用。
（3）将eppendorf 管预热至37℃ 1 分钟。
（4）待标记反应完毕后，取3.5ml 标记反应液至上述4 支eppendorf 管中，稍微离心一下，并将上述四管置于37℃保温。注意在每一次反应中，均应使用新的吸液头，以免交叉污染。
（5）继续保温3-5 分钟（若使用dITP 时，保温时间可延长至30 分钟，对反应产物没有任何影响。
（6）在上述四管中各加入4ml 终止缓冲液。混合均匀后，置于冰浴中。本样品即可上样电泳。用35S 标记反应的样品可置于-20℃保存一周，此时样品只有极少量的降解。而32P 标记的则需在当天电泳以免降解。
（四）测序凝胶板的制备及电泳参考第一节测序凝胶板的制备及电泳部分。样品加热至75-80℃ 2 分钟，立即上样，每个泳道的使用量为2-3ml
（五）测序凝胶板的干燥及放射自显影。
电泳完毕后，经32P 或35S 标记的产物可用对b-射线敏感的X-光胶片放射自显影检测。
1、取下电泳的玻璃板，去除两边的压条，用小的薄钢片撬开玻璃板。若玻璃板用粘合硅烷处理过，凝胶会紧紧地粘合于玻璃板上，则凝胶与玻璃板一起进行下面步骤的处理。如果玻璃板没有经过粘合硅烷的处理，则可用3MM
大滤纸贴在有凝胶的玻璃板上，小心地揭下凝胶，准备下一步的处理。
2、去除尿素，将含有凝胶的玻璃板或滤纸浸于含有2 升10%冰醋酸的大号显液盆中，轻轻振荡15 分钟，去除尿素。
3、干胶：含有凝胶的玻璃板可用电吹风吹干，而含有凝胶的滤纸则可用专用的干胶设备如真空加热干胶仪抽干。
4、已经干燥的凝胶即可进行放射自显影。在玻璃板含有凝胶的这一面加上X-光片后，用另一块相似大小的玻璃板夹住，然后用夹子固定，置于暗盒中曝光。而含有凝胶的滤纸则可置于X-光曝光盒中放射自显影。一般32P 曝光过夜即可，而35S 为2-3 天。
5、曝光完毕后的X-光片即可冲洗，获得序列信息。将X 光片置于水中先湿润，然后置于显影液中显影，直至条带清晰显示为止。X-光片用水淋洗片刻后置于定影液中定影15 分钟以上。取出X-光片干燥并读出序列。
[
注意] 1、去除尿素是非常重要的，如果有残存的尿素，则在干胶过程中会使凝胶很粘，而无法进行放射自显影。可以用10%冰醋酸洗二次，第一次15
分钟，第二次10
分钟。如果胶浓度高于12%，则有可能在干胶过程中会产生皱纹，防止的方法有二种：（1）冰醋酸溶液中加入1%-2%的甘油；（2）不干燥胶，直接在冰箱中以冰冻状态曝光，应注意的是在使用这个方法时，要在凝胶和X-光片之间加一层薄的塑料薄膜。一般来说都使用第一种方法。
2、凝胶一定要充分干燥方可进行曝光，否则X-光片会粘在胶的表面，致使以后的操作困难。
3、曝光时间应根据所使用的同位素而定，如果同位素已过半衰期则应相应延长曝光的时间。