功能基因cDNA序列的分析

（一） cDNA序列的测定
一．原理
DNA 序列测定技术，目前主要是根据Sanger 等提出的酶法和Maxam和Gilber 提出的化学降解法，这两种方法的原理大致相同。这里主要介绍Sanger 的酶法——双脱氧链终止法。
双脱氧链终止法是Sanger 等人于1977 年建立起来的。它是利用了2'，3'-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）可以特异地终止DNA 链延长这一特点进行的。在DNA 聚合酶的作用下，ddNTP 的5'三磷酸基团可以与正在合成的DNA 链中的3'羟基形成磷酸二酯健，当ddNTP掺入到正在合成的DNA链以后，由于3’端是脱氧，不能再进行链延长，由此即可进行DNA分析。

序列分析的原料包括：待测序的DNA 膜板（或cDNA 模板）和一小段与膜板互补的DNA引物。将膜板与引物退火后分成4 个试管进行反应。每个试管中一种ddNTP（如ddATP）与其对应的dNTP(如dATP)按适当的比例混合，再加上其他三种dNTP(如 dCTP,dGTP,dTTP)所用 4种dNTP 中有一种必需是同位素标记的，通常是a32P-dATP 或a32S- dATP，如此分成AGCT 4 个反应管，在聚合酶的作用下，正常的聚合作用即从引物处开始，若掺入的是ddNTP（如ddATP），链延长即停止，若掺入的是dNTP（如dATP），链继续延长，直至掺入另一个ddATP。这样即可得一序列标记的DNA 链，其长度依赖于特定的ddNTP 相对于引物末端的位置。将4个反应管加到聚丙烯酰胺凝胶上电泳，标记片断按大小分离，放射自显影后即可按谱型读出DNA序列。
但双脱氧链终止法存在操作繁琐，效率低，速度慢等缺陷，特别是结果判读的读片过程一项既花时间又乏味的工作。随着科学技术的发展，操作简便、结果清晰，易于解读的自动测序技术于80 年代末发展并成熟起来，并得到了广泛的应用。

DNA 自动测序的最基本原理与双脱氧链终止法一样，也是通过4 个酶学反应利用ddNTPs产生一系列一端固定，另一端终止所有不同的A，T，G，C碱基位点的DNA片断，能够进行自动测序的关键是采用荧光素标记代替了放射性同位素标记显示高压电泳分离结果。根据所用的荧光素种类不同可将目前所用的自动测序方法可大致分为两类。
⑴ 使用4 种荧光素标记的自动测序方法 所用的4 种荧光发色基团在激光的激发下可以产生不同波长的荧光。用4种荧光素分别标记4 种双脱氧核苷三磷酸终止的DNA片断，这可形象比喻为赋予这4 组DNA 片断以不同的颜色。使用4 种荧光素标记的DNA 片断在电泳时将4组反应混合物加入同一样品孔中进行电泳。自动检测仪在胶的下端有一固定的检测窗口，一束激光与穿过这里的DNA 片断相遇，DNA 上的荧光发色基团受激发发出特定波长的荧光，荧光又被高灵敏度的光电管或二极管光电检测器转换成电信号输入电子计算机加以贮存，4 种不同波长的荧光由安放在光电检测器前的旋转滤光片加以区分。这样根据DNA 片断通过检测窗口的时间和颜色等原始信息经计算机处理后就可给出所测的DNA 序列。

⑵ 使用单荧光素标记的自动测序方法 这种自动测序方法更加类似双脱氧链终止法。它使用一种荧光素标记所有的DNA片断，电泳时与双脱氧链终止法一样将4 种反应产物加在4 个样品孔中进行电泳分离。在胶的底部有一个由激光光源和光电检测器组成的检测系统，每个样品道后都有一个检测器。当DNA片断迁移至检测区并与激光相遇时，荧光标记物即被激发发出荧光。荧光被光电检测器接受并转换成电讯号送至计算机贮存。由于按特定的次序加样（如A，C，G，T），所以第一个检测器检测到的信号代表A，第二个检测器检测的信号代表C，以此类推。电泳结束后计算机便收集到一套完整的信号，通过计算机处理后，就得到所测DNA的序列。
二． 序列测定的方法
⑴ 克隆的基因委托TaKaRa 生物工程（大连）有限公司用ABI PRISMTM 377 全自动荧光测序仪完成序列测定。
⑵ 计算目的基因片断的长度，推测其编码氨基酸数量。

（二） cDNA序列的同源性比较
克隆的cDNA是否为新基因？它与其他已发现的基因序列有何异同？这一切可通过相应的软件（如Blast、FastA、PIMA、MAP等）对网上多个DNA序列数据库（Gene Bank、EMBL和DDBJ等）中已登陆的序列进行搜索、比较，了解序列间的相似程度，以判断该片断是新基因还是某基因家族的成员。有些基因的核苷酸顺序与其他基因并无十分高的同源性，仅通过核苷酸顺序的同源性比较无法得到十分有参考价值的信息，然而其编码的蛋白质的氨基酸顺序却可能与其他某些多肽高度同源，从而提示该蛋白的可能功能。因此，从某种程度上说，氨基酸序列的同源性比较有时比核苷酸序列的同源性比较更有意义。
方 法：

最高的基因，确定所克隆的基因是否为目的基因。
③ 确定了为目的基因后，再次登陆NCBI网站主页，在Search的复选框中选择Nucleotide，在for的选框中键入目的的基因，如β- actine，然后按Go键搜索已发表的不同物种的β- actine基因。
④ 经搜索后，网页上会显示一系列物种编码。单击某物种编码查找该物种的基因。将其中若干种物种的β- actine基因的核苷酸序列及氨基酸序列下载下来。
⑤ 根据已知的核苷酸序列，应用计算机软件推出相应的氨基酸序列，并利用相关的软件对所下载的物种的基因的核苷酸序列及氨基酸序列进行多重比较，得出不同物种同一基因的同源性。
⑥ 另外，以便后续工作的进行，登陆NCBI网站查找目的基因已登陆的基因组DNA序列，将所获得的cDNA序列跟已登陆的基因组DNA序列进行比较，弄清目的基因内含子、外显子的位置。