单个神经细胞标记实验

猫的小脑                                                          

利多卡因                                                                  Karnovsky 型固定液                                                                  甲酚紫                                                          

微电极                                                                  电镜或光镜                                                          

微电极

直径 0.4—0.9/xm, 圆锥形，电极内液为含 4%~10%HRP 的 0.5mol/LKCl-Tris 缓冲液，pH 为 7.6，电阻抗为 35~60Mfl。

一、注射

每秒 3~5 次去极化直流电脉冲，每次通电时间 100?200ms, 电流强度为 3~5nA, 持续时间为 3~5 min。

二、固定

根据神经细胞的大小及需要充填的范围，可于注射 HRP 后 15 min 到 30 h 固定动物。先用含 2% 利多卡因的 0.9% 生理盐水经血管进行灌注，利多卡因的量为 40 mg/kg，再用 Karnovsky 型固定液灌注（含 1% 多聚甲醛、2% 戊二酸和 2.5% 葡萄糖的磷酸钠缓冲液，pH 为 7.3, 终浓度为 0.1md/L)。

三、切片及处理

连续冷冻切片（光镜）或振动切片（电镜或光镜)，片厚 50~60pm, 切片收集于磷酸盐缓冲液；DAB 反应；光镜的切片用明胶贴于铬矶涂层的载玻片上（用甲酚紫复染)。电镜或光镜切片先用丙酮脱水，再用环氧树脂包埋。

结果

Purkinje 细胞的胞体和树突在 Golgi 法染色和 HRP 细胞内标记后具有非常相似的形态，只是在用 HRP 标记时，最细小的分支（树突棘）也能很好地显示 [至少在 a 运动神经元是这样，Brown 和 Fyffe(1981) 的研究工作表明用 HRP 进行细胞内标记比以往任何方法都能更完整地显示神经细胞的树突结构]。然而，用 HRP 进行细胞内标记的时候，在标记轴突的同时，还能标记轴突侧支及终末分支（图 1-6)，而 Golgi 法仅能染出轴突无髓鞘包被的初始部分（图 1-5B)。除了功能方面的诸多应用以外，可将 HRP 法用于研究皮质-核团之间投射的精细结构和组合（organisation)。