单克隆抗体的细胞融合(cellfusion)过程

融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。
 
融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1不等。3:1或5:1最为常用。
 
1．试剂与材料
 
(1) 供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。
 
(2) 1640培养液100ml。
 
(3) 完全1640液100ml。
 
(4) 2.5％FCS－1640液50ml。
 
(5) HAT培养液100ml。
 
(6) 50％PEG：取分子量4 000，高纯度的（日本进口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前用预热于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚红检查pH，一般不必调pH。如pH有改变，可用HCl或NaHCO3调整。
 
(7) 10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。
 
(8) 40孔塑料培养盘。
 
2．操作方法
 
⑴ 准备好脾细胞。
 
⑵ 在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml 2.5％FCS－1640液。
 
⑶ 室温400g离心3min，使细胞沉淀。
 
⑷ 移去上清液。
 
⑸ 轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于40℃水浴中，使其达融合温度。
 
⑹ 加预热至40℃的50％PEG 0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续2min。
 
⑺ 加1ml1640液，边加边摇动，持续1min。
 
⑻重复⑺一次。
 
⑼ 加1ml 1640液，边加边摇动，持续0.5min。
 
⑽ 重复⑼一次。
 
⑾ 加1640液15ml。
 
⑿ 室温，400g离心1min，使细胞沉淀。
 
⒀去上清，轻敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。
 
⒁ 往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液，每孔1滴（约0.05ml）。
 
⒂ 轻摇后，放入5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育。
 
⒃ 第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的饲养细胞。
 
⒄ 于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察，大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在10~20天内出现，但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查抗体。

 
⒅ 对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS－1640液。同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查抗体，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。