噬菌体抗体ELISA

实验概要

噬菌体ELISA是一种快速而便捷的方法，尤其是因为pⅧ有多拷贝会导致信号的扩增。

主要试剂

1. 2％MPBS

2. PBS/Tween

3. 辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗噬菌体单克隆抗体(mAb)(Amer Sham BiOSCiences)

4. 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)液体底物系统(SigmaT—8665)

5. 终止液(1mol/L H₂SO₄)

主要设备

96孔ELISA板，例如Nunc maxisorb442404(可自VWR购得)

实验材料

噬菌体样品

实验步骤

1．按每孔100ul蛋白抗原包被微量滴定板，4℃过夜。PBS中10ug/m1的浓度是包被抗原的标准浓度。但有时需要更高的浓度或者不同的包被缓冲液(比如碳酸盐缓冲液)。

2．弃去抗原液并用PBS洗涤板孔2次。

3．加入200wl的2％MPBS封闭板孔，37℃孵育2小时。

4．用PBS洗涤板孔 3次。

5．每孔加入50ul的4％MPBS。

6．每孔加入50ul含噬菌体抗体的培养基上清，用移液器反复吹吸混匀，室温孵育1小时。

7．弃去溶液，用PBS/Tween洗涤板孔3次，再用PBS洗涤3次。

8．将HRP标记的小鼠抗噬菌体单抗用2％MPBS按照1：5000稀释后，每孔加入100ul；室温孵育1小时。

9．弃去二抗，并用PBS/Tween和PBS分别洗涤3次。

10．每孔加入100ul TMB系统溶液，并在暗处室温孵育10～30分钟。数分钟内，应呈现蓝色。

11．每孔加入50～100ul终止液，终止反应。

12．在450nm处读板。