四款主流的激光捕获显微切割平台（下）

　　目前市场上主要有四家公司提供激光显微切割的平台，他们分别是Arcturus/Life Technologies、徕卡、蔡司和MMI。在上一篇文章中，我们介绍了前两个，这回则带您看看MMI和蔡司的产品，以及新手该如何选择。

　　MMI

　　瑞士MMI公司的单细胞获取平台有两大旗舰产品：CellEctor Plus单细胞分选系统和CellCut Plus激光显微切割系统。

　　• CellEctor Plus可从血液、骨髓、制备的组织细胞悬浮等液态体系中挑选出感兴趣的单细胞;

　　• CellCut Plus可从组织切片、贴壁培养细胞中将感兴趣的单细胞切割并收集下来。

　　CellCut Plus利用固态紫外激光对组织切片等样本中感兴趣的细胞进行切割和收集，“三明治”式的样本制备方式避免环境尤其是RNase污染。在整个分离过程中，激光都不与需要分离的样本接触，对样本损伤小，从而保证了样本RNA的完整性。

　　此系统在样本收集时采用PTP(Predefined Target Positioning)技术，将黏性管盖划分成若干区域，对组织切片中同种类型细胞进行黏附收集，提高样品的收集效率，节省成本;通过计量统计可保证下游的核酸、蛋白实验有足够的样本量。

　　CellEctor Plus和CellCut Plus均是基于显微镜的产品，两大系统可完全整合在一起形成MMI单细胞获取自动化工作站，以“所见即所得”的方式，几乎涵盖所有的单细胞获取途径。

　　蔡司

　　蔡司的PALM MicroBeam也是利用聚焦激光束来切割和分离样本，不过它收集样本的方式比较特别。通过一种激光诱导的压力波将细胞弹入管中。MicroBeam的弹射力就好像在您的样品下方发生光诱导的微型爆炸，随之而来的冲击波向上推动组织。对于较大的区域，MicroBeam也可以使用粘性管盖。这对蛋白质组研究特别有用，因为您可能需要较大的样品来获得足够的信号。

　　专家的选择和建议

　　你们若打算采购一台LCM仪器，一定会被繁复的仪器参数和众多专业术语绕晕。撇开这些不谈，我们先看看专家会选择何种仪器，开展哪些应用。

　　LCM技术的发明人Lance Liotta如今是乔治梅森大学(George Mason University)应用蛋白质组学和分子医学中心的联合主管。他们实验室拥有三台LCM系统，都是来自Arcturus：第一代手动的PixCell 仪器;具有图形用户界面的Veritas系统;以及最新的双激光ArcturusXT™。

　　据Liotta介绍，实验室主要在临床试验工作中使用这些仪器。举个例子，该中心临床蛋白质组实验室的主管Virginia Espina在抗癌药物治疗前后，对100名乳腺癌患者的肿瘤组织进行显微切割。之后从那些样品中提取蛋白，上样到蛋白芯片上，以确定药物对近60个蛋白标志物的量和磷酸化的影响。此信息有望指导治疗决策。

　　Espina建议用户在准备开展激光捕获工作之前，考虑四个关键问题。第一，组织如何固定?是福尔马林包被石蜡包埋(FFPE)还是冷冻?它是新鲜的还是存档的?第二，你希望用它做什么?DNA相对容易收集，而RNA迅速降解。第三，你需要多少细胞?核酸可以扩增，因此可研究相对少量的细胞甚至单细胞。蛋白则需要更多材料。通常来说，大约在10000至50000个细胞。第四，你将使用哪种提取方法，它是否与下游实验兼容?

　　在美国SAIC-Frederick公司的组织技术实验室，研究助理Yelena Golubeva使用两种系统开展LCM工作：一台Arcturus的PixCell IIe和一台MMI的CellCut Plus。前者是用于切割相对小的区域，从单细胞到直径在25微米左右的区域。对于大的区域，她使用MMI，因为激光切割更快。

　　Golubeva认为，就LCM而言，每个样品都是独特的。例如，小鼠肝脏样品的RNA相对稳定，而前列腺样品几乎马上开始降解。这是个经验问题。

　　Golubeva建议用户开展一些预实验。从一些感兴趣组织的切片开始。检验一下你希望使用的染料，看看它是否会损害你想要研究的生物分子。染色一块切片，从上面刮下一些细胞，提取出RNA，并与未染色切片的结果进行比较，了解整体质量和qPCR数据。如果OK，那么可以使用这种染料。

　　接下来，优化时间。在RNA质量下降之前，你能够在切割上花多少时间?十分钟?二十分钟?Golubeva认为，使用什么样的仪器都不要紧，你需要知道组织在LCM仪器以及你使用的耗材中表现如何。

　　专家也建议我们了解其他一些变量，比如切割的速度和力量，就像我们之前提到的徕卡LMD7000和LMD6500。7000的功率和频率可调，也能切割更硬的切片，比如骨头、牙齿以及植物纤维组织。

　　一般来说，冷冻切片最好在当天进行显微切割，切好的冷冻切片可暂时存放在-70℃低温冰箱备用。冷冻切片厚度约为10 μm，较厚的切片容易捕获到较多的细胞，但有可能导致非特异性地捕获邻近的细胞，较薄的切片捕获细胞量相对较少，但捕获的细胞比较纯净。

　　关于LCM，目前已经有3000多篇文献发表，新应用和新方法也在不断涌现。但如果你是新手，那么不妨读一读Lance Liotta实验室2006年发表在《Nature Protocols》上的操作方案1。