在质粒载体中进行定向克隆实验

T4 噬菌体 DNA 连接酶 限制性内切核酸酶

ATP 乙醇 苯酚 氯仿 乙酸钠 TE

琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 旋转柱层析装置

一、材料

1. 缓冲液和溶液

ATP (10 mmol/L)，乙醇，苯酚：氯仿（1:1, V/V)，乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2)，TE ( pH 8.0)。

2. 酶与缓冲液

T4 噬菌体 DNA 连接酶，限制性内切核酸酶

3. 凝胶

琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶。

4. 核酸和单核苷酸

载体 DNA ( 质粒），外源或目的 DNA 片段。

5. 专用设备

旋转柱层析装置，温度可调 16℃ 的水浴装置。

二、方法

1. 用两种适当的限制性内切核酸酶消化载体（10 ug ) 和外源 DNA 片段。

为进行直接克隆，用两种限制性内切核酸酶消化闭合环状的质粒载体，这样可以识别不同的序列以及产生不同的末端。无论哪段序列，我们应尽可能避免选用在多克隆位点上相距 12 个碱基以内的酶切位点，如果有一个酶切位点被切开，那么第二个酶切位点将离线状 DNA 分子的末端很近而影响第二个限制酶的酶切效率。在 New England Biolaba 公司的产品目录中列出了各种限制酶在线状 DNA 分子末端位点的酶切效率。

阅读生产厂家的说明以确定两种限制酶是否可在同样的缓冲液中工作。如果可以，就能用两种限制酶同时对质粒 DNA 进行消化。如果两种限制酶用不同的缓冲液，最好让消化反应分开进行。此时. 应首先使用适于低盐浓度的酶。在第一个酶的反应完成后，取少量消化产物通过电泳来确定是否所有的质粒 DNA 已从环状变为线状分子，然后适当调整缓冲液的盐浓度，再加入第二个酶。

2. 苯酚：氯仿抽提及乙醇沉淀法纯化被消化的外源 DNA 片段。

根据实验情况，我们可以参照琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳技术从外源 DNA 消化产物中分离出目的片段。当外源 DNA 片段制备物中含有能与代替连接的多个限制酶酶切片段时，一般需要做这种纯化。许多研究者在连接反应前，常利用琼脂糖凝胶电泳技术来提高外源目的 DNA 序列的纯度，而不是大量筛选转化子以获取所需的克隆。

3. 离心柱层析加常规乙醇沉淀纯化载体 DNA

这一纯化步骤可以从质粒制备物中除去那些由多克隆位点中两个靠近的限制酶位点经限制酶消化后所产生的小片段 DNA。

4. 用 TE ( pH 8.0) 重新溶解纯化出的两份 DNA 沉淀，使终浓度约为 100 ng/ml。假设 1 bp 相当于 660 Da, 计算 DNA 的浓度（pmol/ml )。

琼脂糖凝胶电泳检査两份 DNA 样品的大概浓度。

5. 按下列表格将适量的 DNA 转移至 0.5 ml 的无菌微量离心管中：



(1) A、B 和 C 管中加入：10x 连接缓冲液 1.0 ul，T4 连接酶 0.1 Weiss 单位，10 mmol/L ATP 1.0 ul，H₂O 补至 10 ul。

(2) D 和 E 管中加入：10X 连接缓冲液 1.0 ul，10 mmol/L ATP 1.0 ul，H₂O 补至 10 ul，无 DNA 连接酶。

在制备 DNA 片段的过程中，可以将 DNA 片段与水一起加入管中于 45℃ 温育 5 min，以消除重新复性而导致的末端相互聚合。在连接反应试剂加入之前，可将 DNA 溶液于 0℃ 预冷。为获得最大效率的连接，反应体系越小越好，一般为 5~10 ul。在反应混合物中，ATP 如作为 10X连接缓冲液的组分，可给载体和外源 DNA 插入片段的体积提供了更大的空间。有些厂家的连接缓冲液中包含有 ATP，这样在应用时就不必另加 ATP 了。

6. 连接反应混合物置于 16℃ 过夜或 20℃ 4 h。

7. 用稀释的连接产物转化感受态大肠杆菌。转化时，应包括用标准方法制备的已知量的超螺旋质粒 DNA 作为对照，以检査转化效率。