在质粒载体中进行平末端片段的克隆
1．分别设立两个反应，用适当的限制性内切核酸酶消化1~10μg质粒DNA和外源DNA片段，使它们能产生平末端。
2．苯酚：氯仿抽提与乙醇沉淀法纯化出已被消化的载体和外源DNA片段。
3．分别用TE（pH 8.0）重新溶解纯化出的两种DNA沉淀，使终浓度为100 ng/ml。 假设1 bp相当于660 Da，计算DNA的终浓度（pmol/ml）。
4．将载体DNA去磷酸化。
5．按下表将适量的DNA转移至无菌的0.5 ml离心管：
管号 | DNA |
A和E | 载体1 [60fmol (~100ng)] |
B | 外源插入片段2[60fmol (~10ng)] |
C和F | 载体1（60fmol）和外源插入片段3（60fmol） |
D | 线状载体（5’-磷酸化）（60fmol） |
G | 环状载体[60fmol (~10ng)] |
1 载体DNA已进行去磷酸化
2 外源目的DNA可以连接接头。
3 连接反应中，质粒载体和插入的DNA片段摩尔比一般为1：1。DNA的总浓度应约为10ng/μl。
a. A、B和C管中加入：
10×连接缓冲液 1.0μl
T4噬菌体连接酶 0.5 Weiss单位
5 mmol/L ATP 1.0μl
H2O 补至8.5μl
30%PEG 8000 1~1.5μl
b. D、E和F管中加入：
10×连接缓冲液 1.0μl
5 mmol/L ATP 1.0μl
H2O 补至8.5μl
30%PEG 8000 1~1.5μl
不加DNA酶
6．连接反应体系置于16℃水浴温育过夜或20℃水浴温育4 h。
7．用每份稀释的连接产物转化感受态大肠杆菌。转化时，应包括用标准方法制备的已知量的超螺旋质粒DNA作为对照，以检查转化效率。
管号 | DNA | 连接酶（有/无） | 预期转化克隆数 |
A | 载体1 | + | ~03 |
B | 插入片段 | + | 0 |
C | 载体1和插入片段 | + | 比F管高5倍 |
D | 载体1 | - | ~0 |
E | 载体2 | - | 比D管高50倍 |
F | 载体和插入片段 | - | 比D管高50倍 |
G | 环状质粒 | - | 2×105 |
1 去磷酸化
2 未去磷酸化
3 如果出现来自去磷酸化的载体DNA自身连接产物的转化子，是由于用碱性磷酸酶处理时未能除尽5’端的磷酸基。
