仪器及器皿
THZ-C恒温震荡器,LRH-250生化培养箱,LDZX-50FB立式电热压力蒸汽灭
菌器,SW-CJ-1F洁净工作台,百分之一电子天平,生物显微镜, 18×150试管,90mm培养皿,500ml三角瓶,10ml刻度吸管,1ml移液枪,吸耳球,玻璃珠(直径4-6mm),pH试纸(5.5-9.0)
试剂
氯化钠(分析纯),葡萄糖(分析纯),蛋白胨(生化试剂),牛肉浸膏(生化试剂),柠檬酸铵、磷酸氢二钾、酵母膏、乙酸钠、硫酸镁、硫酸锰、吐温-80、进口琼脂等 3.具体步骤 准备工作
1 MRS琼脂培养基的配制及灭菌:葡萄糖20g、柠檬酸铵2g、乙酸钠5g、磷酸氢二钾5g、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.2g、牛肉膏10g、酵母膏5g、蛋白胨10g、吐温-80 1g、琼脂16g、水1000mL 、pH5.5-6.0,118℃灭菌30min。
2 其他物品的包装及灭菌:500ml三角瓶、培养皿、1ml移液枪、10ml刻度吸管、玻璃珠、18×1500试管等用牛皮纸包裹好,0.85%生理盐水置于1000ml三角瓶和250ml三角瓶,1ml枪头盒(内置枪头)、灭菌器121℃30分钟。
3 洁净工作台的准备:操作前将所需物品置于台面,紫外线灭菌30分钟再进行操作。
样品制备
采样应不少于500克,采用称量纸称取25.00克(精确到0.01g),倾入 已加入灭菌玻璃珠的干燥已灭菌500ml三角瓶中,用100ml量筒量取先100ml已灭菌的生理盐水沿瓶壁倾入500ml三角瓶,摇匀,约2分钟,再量取125ml已灭菌的生理盐水沿瓶壁倾入500ml三角瓶,然后包裹起来于旋转式摇床上200r/min充分振荡30min,即成母液的菌悬液。 3.3 样品处理
1 用移液枪取1ml上述母液的菌悬液加入盛有9ml无菌水的试管中,混匀成1:102稀释的菌悬液,这样依次稀释,分别得到1:103、1:104……1:107等浓度(每个稀释度必须更换无菌吸管)。
2 取1ml不同稀释度菌悬液加入培养皿内,与琼脂培养基混匀。每个样品取3个连续适宜稀释度,每一个稀释度重复3次,同时加无菌水的空白对照。置于生化培养箱37℃培养48h,每个稀释度取5~10个菌落的菌体,涂片染色,显微镜观察识别后计数菌落。
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