基因修饰和动物模型

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　　生物通报道：转基因技术的出现成功实现了将目的基因插入到实验动物的基因序列中, 这为研究疾病的分子机理提供了极其有用的工具。近期来自中科院上海高等研究院，干细胞和纳米医学研究中心等处的研究人员针对当前构建靶向转基因动物模型的各种技术进行了解析和评估。

　　转基因小鼠模型是通过显微注射的方法将DNA(目的基因)注射入原核内, 这种典型的技术在遗传学界已经广泛应用了30 年. 然而, 这种传统的转基因技术缺乏精确定位: DNA片段被随机地、多拷贝地插入, 形成连环体; 插入的DNA片段易发生突变; 或因为插入位点的限制, 发生位置效应, 使得目的基因的表达不稳定, 甚至不表达。以上种种现象导致了在应用随机转基因技术的时候, 需要获得多个原代鼠, 以筛选符合实验设计的转基因表型。

　　目前, 通过在目的基因两侧插入绝缘子序列可以保护转入的基因不受周围调控因子影响, 这种方法可以部分解决随机转基因技术带来的位置效应问题. 同时, 细菌载体大片段DNA (<300 kb)也可以减少位置效应的发生. 然而, 动物携带多拷贝的大片段基因可能造成不可预计的表型. 根据现有的研究结果, 目前最有效的解决位置效应的方法是将目的基因插入到特定基因位点, 即靶向转基因, 如目前快速定点的转基因技术TARGATTTM。

　　在这篇文章中，研究人员就靶向转基因技术和基因修饰领域中的新兴技术进行了评述。其中也详细介绍了利用ZFNs和TALEN实现位点特异的转基因插入。

　　ZFNs和TALEN是一类重组DNA结合蛋白, 通过在用户指定的位点形成DNA双链断裂, 促进高度特异性的有针对性的基因组编辑. Brinster等人在多年前发现, 原核注射过程中可能发生同源重组, 但频率非常低. 利用ZFNs和TALENs技术对限制性核酸内切酶进行设计, 使之靶向基因组中的特定位点. 随后核酸内切酶造成靶位点的双链断裂, 该损伤可以通过非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)进行修复而产生裂解位点的突变, 或由同源重组方式修复.

　　虽然ZFNs和TALENs的核酸酶部分也有类似的性质, 这2种重组的核酸酶之间的区别是在其DNA识别肽部分. ZFNs结合3个碱基对, 而TALENs与单个核苷酸结合, 使它们可以靶向基因组上的任何地方. 此外, 与ZFNs相比,TALENs基因编辑便于用户使用, 甚至连非该领域的研究人员也可操作, 而且生产成本低. TALENs定位遵从相对简单的设计参数, 不依赖于上下游的序列, 通常可以比ZFNs靶向更多的基因组位点。

　　通过直接向胚胎注入基因靶向分子复合物并产生后代, 人们利用ZFNs和TALENs成功地构建了“基因敲除”的小鼠和大鼠模型, 而不需使用相应类型的干细胞. ZFNs 和TALENs直接注射入大鼠和小鼠胚胎的原核后, 主要通过NHEJ途径, 产生的后代中20%~70%的幼崽携带一个或多个突变. 这提供了一个高效率的建立“基因敲除”的方式. 然而, 对于“敲入”模型需要进行同源重组(homologues recombination, HR), 而其在切割位点的效率是很低的. 据 报道, ZFN 或TALEN辅助同源插入转基因占出生小鼠的1%~5%.

　　通常情况下, 这些动物是嵌合体, 还携带NHEJ引起的突变, 需要进一步鉴别饲养. 同时, 也存在未被发现的ZFN或TALEN脱靶影响的可能性. 目前ZFN或TALEN介导的同源重组的效率仍然远低于其基因组报道的由PhiC31介导的特定位点的整合插入. 此外, 目前ZFNs的成本使大多数实验室望而却步. 如果能够增加效率, 比如通过阻断NHEJ促进同源重组, 降低成本, ZFN 和TALEN的介导的基因修饰将成为靶向转基因的主要手段。

　　此外研究人员还介绍了基因修饰领域的新兴技术，如Cre和Flp主要应用于靶向等位基因的条件性操作; PhiC31, ZFNs, TALEN等应用于精确和高效地进行胚胎基因组微调.

　　在2013年2月15日的Science上, 哈佛Church博士研究组联合麻省理工-哈佛Broad研究所的Zhang博士研究组在同一期分别报道了使用CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats, 集群定期空隙短回文重复)/CRISPR相关系统(CRISPR-associated, CAS)在小鼠和人类细胞进行定点的基因组编辑.

　　之后, 在2013年5月9日的Cell杂志中, 麻省理工学院Broad研究所的Jaenisch研究组发表了另一篇关于CRISPR/CAS介导的基因工程技术论文, 阐述了一步到位地构建多靶点基因突变的小鼠模型。

　　作者指出，CRISPR/CAS 系统可以快速地构建多靶点基因修饰的动物模型, 从而大大加速该基因家族的活体功能研究和各基因间相互影响的研究.然而, 在应用该系统的过程中, 构建条件性等位基因、或精确地插入大片段的DNA(如报告基因GFP)、或进行条件性敲除及构建特殊基因的报告小鼠的成功率还不清楚. 目前, 条件性敲除小鼠只能在干细胞中通过同源重组的方式才能实现. 另一方面, 将大片段的DNA精确地插入特定位点可通过整合酶TARGATT的方法实现。