实验材料 | 玻璃及塑料器皿 |
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试剂、试剂盒 | 溶液与缓冲液 引物 |
仪器、耗材 | 试剂盒 MPC-E PCR仪 Gene PulserII 型系统 |
实验步骤 |
一、一般原则
若用于 SAGE 的 RNA 有足够的量,最好用 2.5~5 ug polyA+RNA, 可按实验方案 A 进行。这里我们还提供了实验方案 B,它在多个步骤上已做了修改,适用于仅有微量的原材料(例如,利用这个流程我们能从来自于 300fxm 脑切片的海马样品中获得基因表达谱)。后一实验方案尤适用研究神经组织表达,由于其复杂的神经环路及高度特化的结构,获得大量均质组织以分离 RNA 往往是不可能的。
下面对两组实验方案第 1 步到第 8 步进行了详细的描述,从第 9 步起两组方案步骤相同。
二、mRNA 的分离
实验方案 A
许多试剂盒分离 PdyA+RNA 的效果都很好,我们推荐使用 mRNADIRECT 试剂盒(Dynal;610.11) 来从组织中或培养的细胞中分离 polyA+RNA,或者用 mRNA 纯化试剂盒(Dynal;610.01) 从总 RNA 中分离 pdyA+RNA。在试剂盒说明书中对所有步骤有详细的描述。
实验方案 B
1.TRIzol 分离总 RNA(见 DD 实验方案)。
2.在 RNA 沉淀后,将 1~10 吨总 RNA 重悬于 20 ul 裂解缓冲液中(mRNA 捕获试剂盒)。
3.稀释 20X 生物素化的 oligo(dT)20 引物(mRNA 捕获试剂盒)到最终浓度为 5Pmol/ul。
4.将 4 ul 稀释的引物加入到含有 RNA 的裂解缓冲液中。
5.在 37℃ 退火 5 min。
6.转移 RNA 到一个链霉抗生物素包被的 PCR 管中(mRNA 捕获试剂盒)。
7.在 37℃ 保温孵育 3 min(在此步中通过链球菌素-生物素结合 mRNA 被固定于试管壁上)。
8.移去管中溶液(含有未结合的 RNA 片段:rRNA、tRNA 等),用 50 ul 洗液小心地冲洗试管 3 次(mRNA 捕获试剂盒)。
9.去除洗液。
10.立即进行 cDNA 合成步骤。
三、cDNA 合成
实验方案 A
1.以 oligo(dT)-引物加入 2.5~5 ug polyA+RNA 合成 cDNA。
2.在 0.5 mlPCR 管中混合(冰上操作):
—2.5 ul polyA+RNA(1 ug/ul)
一 4 ul 5X 第一^缓冲液
—2 ul 0.lmol/LDTT
—1 ul 10 mmol/LdNTPs
一 1 ul oligo(dT)18(生物素化的)(0.5ug/ul)
一 1 ul SuperScriptHRT(200ug/ul)
—8.5 ul DEPC 水
总体积为 20 ul。
3.42℃ 孵育 2 h(可在 PCR 仪中进行)。
4.在冰上加单链 cDNA 进行第二链合成:
—(20 ul 单链 cDNA)
一 16 ul 5x 第二链缓冲液
—1.6 ul 10 mmol/LdNTPs
—2 ul DNA 多聚酶 I(10u/ul)
—1 ul T4DNA 连接酶(5u/ul)
—1 ul RNase H(5u/ul)
一 38.4 ul 重蒸(馏)水
总体积为 80 ul。
5.在 16℃ 孵育 2 h。
6.用 LoTE 扩容至 200ul。
7.加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)(PCI)。
8.振荡。
9.在 4°C 微量离心机中以 13OOOr/min 离心 5 min。
10.转移上层水相至一新 1.5 ml Eppendorf 试管中。
11.乙醇沉淀:
—3 ul 糖原
一 100 ul 10 mmol/L 乙酸铵
一 700 ul 乙醇
12.置于-20°C 下 30 min。
13.在 4”C,在微量离心机中以 13OOOr/min 离心 15 min。
14.以 500 ul 70% 乙醇有力振荡冲洗沉淀两遍。
15.去除 70% 乙醇,让沉淀物在空气中风干约 15 min。
16.将沉淀重新悬浮于 20 ul LoTE 中。
实验方案 B
1.用 50 ul 1 第一链缓冲液冲洗捕获 PolyA+RNA 的试管,然后移去缓冲液。
2.用下述步骤代替 IX 第一链缓冲液(在冰上移液):
—4 ul 的 5X 第一链缓冲液
一 2 ul 的 0.1mol/L TT
一 I ul 的 10 mmol/LdNTPs
一 1 ul 的 SuperScriptII RT (200 U/ul)
—12 ul DEPC 水
总体积为 20ul。
3.42℃ 下孵育 2 h(在 PCR 仪进行)。
4.从试管中移去反应混合物,并以 50 的 IX 第二链缓冲液洗涤试管 1 次 (mRNA 捕获试剂盒)。
5.移去冲洗液,用 5 〇 4 的 IX 第二链缓冲液洗涤试管 1 次。
6.用下述溶液替代 IX 第一链缓冲液
一 4 ul5X 第二链缓冲液
_0.4ul 的 IOmmol/LdNTPs
—Iul DNA 多聚酶 I (10 U/pl)
—0.5ulT4DNA 连接酶(5U/-)
—0.5ul RNaseH(5U//^l)
—13.6 ul 蒸馏水
总体积为 20ul。
7.在 16℃ 下孵育 2 h。
双链 cDNA 可保存于-20℃, 或者直接在下一步中应用(以锚定酶消化 cDNA)。
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