多光子显微镜成像：无标记成像在发育生物学中的应用

光学成像可用于发育生物学，从而了解生物体的形成、揭示组织再生机制、认识并管理先天性缺陷和胚胎衰竭等。其中最受关注的两个问题：一是心脏在早期发育中会发生剧烈的形态变化，其潜在功能和生物力学方面仍有待研究；二是中枢神经系统发育异常会导致先天性的疾病，所以需要从动力学、功能和生物力学等方面对大脑发育过程进行了解。

许多光学显微镜都依靠使用荧光标记物来对特定分子或物质进行标记然后成像。但是荧光标记有标记不均匀、光漂白、荧光剂干扰细胞功能、荧光剂无法标记小分子等问题。所以，无标记成像对于发育生物学十分重要。

表1列出了多种应用于发育生物学的无标记成像：OCT为光学相干层析成像，OCM为光学相干显微镜，RM为拉曼显微镜，BM为布里渊显微镜，SHGM为二次谐波显微镜，THGM为三次谐波显微镜，OPT为光学投影层析成像，PAT为光声层析成像，PACT为光声计算机断层扫描，PAM为光声显微镜，QPI为定量相位成像。

表1 应用于发育生物学的无标记成像 ［1］OCT是一种基于低相干性干涉测量法的光学成像技术， 主要应用于组织结构、脉管系统、血液循环和生物力学的成像。其分辨率1－15 um，成像深度在1－2 mm量级，具有非侵入式、无预处理、快速成像、实时3D建模评估等优点。OCT可分为时域OCT和频域OCT（图1）。时域OCT利用光程匹配的组织反射光与参考光的干涉信号成像，因此需要调节参考镜的位置来扫描不同深度的组织信息。频域OCT的参考镜是固定的，仅通过测量组织反射光和参考光叠加后的光谱并作傅里叶变换，即可获得与时域OCT相同的结果。相较于时域OCT，频域OCT的灵敏度和成像速度均大幅提升。

图1． 时域OCT与频域OCT的原理示意图 ［2］OCM是OCT和共聚焦显微镜相结合的产物（图2）， 主要应用于细胞结构和组织结构的成像。相较OCT，OCM的对比度来源更丰富，空间分辨率也更高，3D分辨率达到1－2 ？m的同时可保持约0．5 mm的成像深度。OCM常用于植入前发育的胚胎成像。鉴于OCM与OCT相同的对比机制，也可用于功能性OCM成像，例如血管造影。

图2． 一种OCM的示意图 ［3］RM主要应用于生物分子的成像， 对于胚胎成像，RM可提供非常丰富的分子信息。例如，在植入前阶段，脂质在胚胎发育中起重要的代谢作用。RM可以对脂质液滴的数量和空间分布进行长期的评估，从而进一步表征脂质在胚胎发育中的功能。BM是一种基于探测布里渊散射的非线性成像方法， 主要应用于生物力学成像。布里渊散射是光在介质中受到各种元激发的非弹性散射，其频率变化表征了元激发的能量。与拉曼散射不同的是，布里渊散射涉及的是能量较小的元激发，如声学声子和磁振子等。光波与千兆赫兹频率的声波（声子）相互作用，所产生的光频移反映了样品的高频弹性模量。因此，BM可用于测量材料的弹性性能，对于探测胚胎的韧性（刚度）具有很高的价值。SHG过程对有序的非中心对称分子结构具有高度特异性，因此可为某些细胞和组织成分（如胶原蛋白、微管和肌球蛋白）提供清晰的成像对比度，这对胚胎评估非常有用。例如，SHG显微镜可用于对果蝇胚胎的肌肉结构和气管系统成像。以及用于小鼠胚胎心脏中纤维结构的3D成像，显示了心脏纤维含量和组织的时间变化和空间异质性（图3）。

图3． 胚胎第8．5天时小鼠胚胎心脏中的纤维结构的SHG成像。（A） 整个心脏的SHG图像的3D重建，包括原始心房、原始心室和流出道；（B、C） （A）中所示位置的横截面图；（D－F） （A）中所示位置：（D） 流出道和（E、F） 心室的放大图像；（F）在心脏表面以下15米处。［1］THG通常发生在折射率失配的结构界面处。对于胚胎成像，THG显微镜主要用于提供高分辨率的结构信息。另外，由于THG信号能够很好地描绘细胞膜，THG显微镜还可用于细胞追踪，包括探测秀丽隐杆线虫胚胎的早期细胞分裂以及测量青蛙胚胎的血流速度。光学投影层析成像（OPT）与CT原理相同（图4）。首先得到样品在不同方向上的投影数据，然后经计算机重建得到样品的三维结构。OPT成像模式有两种：透射OPT（或明场OPT），其对比度来自样品的光吸收；发射OPT，其对比度来源于样品的自发荧光信号或荧光染色剂信号。基于荧光的OPT是研究整个胚胎中3D基因表达模式的重要方法，基于无标记吸收的OPT则主要用于了解器官的形态，用于胚胎的定量形态成像。无标记OPT也被用于早期人类胚胎的成像，着眼于大脑发展，表明神经系统中的许多结构都可以在3D模式下被识别。

图4． 计算机断层扫描技术（CT）原理示意图。［4］PAT的原理为光声效应：当激光照射组织时，组织会吸收激光的能量，温度上升并膨胀。当目标组织被周期性强度调制的激光照射时，则会发生周期性的热胀冷缩，从而发出超声波。光声成像检测的便是组织受光激发产生的超声信号。在成像过程中，组织受激光照射热胀冷缩，在组织内部形成了一个初始声场。超声换能器在组织周围接收传播出来的声波，利用声波信号和相应的重建算法，反向重建出初始声场，从而得到组织的激光吸收率分布图像（图5）。而且，由于样品内部不同深度位置的声信号到达样品表面的超声信号存在时间差异，利用时间分辨技术可获得不同层析面的光声信号，由此可重建3D的光声图像。

图5． PAT的原理示意图。［5］PAT不仅是非侵入式，无需标记的成像方法，还结合了光学高对比度和声学高分辨率的优势。通过施加不同的光波长，PAT还有极其丰富的对比度来源，如血红蛋白、黑色素、DNA ／ RNA、脂质和水。利用氧合和脱氧血红蛋白的不同吸收光谱，PAT不仅可以进行脉管系统的结构成像和血液循环功能成像，还可以进行氧饱和度和耗氧代谢成像。相衬显微镜技术用于弱散射或吸收光的生物样品（例如植入前的胚胎）。基于透射明场显微镜，通过相干光干涉来探测相衬，从而分辨出相对透明的细胞成分。定量相位成像（QPI）作为一种先进的相衬显微镜技术已被用于不同类型的细胞，并在了解神经网络组织、同时评估细胞运动和生长以及测量细胞力学方面得到了应用。以上这些用于发育生物学的无标记成像模式之间存在相似的成像功能，接着比较一下它们针对特定应用的差异：OCT和OPT均可用于组织结构和形态的成像，且都有微米水平的分辨率。其中OPT具有更高的成像深度，能够覆盖整个大尺寸胚胎，而OCT由于成像深度的限制，仅限于探测靠近表面的组织结构。不过，OCT可用于活体动态成像，OPT则不适合。对于血管成像，PAT直接测量血红蛋白的光吸收，可以从组织内部深处进行体积重建，而OCT通过功能性血流分析只能以相对有限的深度实现脉管系统成像。但OCT的优势是能够对脉管系统和高分辨率组织结构同时成像，这点PAT难以实现。对于胚胎组织的生物力学成像，基于OCT的弹性成像需要适当的负荷（loading）才能传递到目标位置。对于心脏，主动收缩力是自然负荷，使OCT能够评估心脏壁的应变和应变率。但是，对于其他器官或组织，OCT的生物力学成像可能会因缺乏合适的负荷（suitable loading methods）而受到限制。与OCT不同，BM进行生物力学成像，不需要外部负荷（loading），理论上能够应用于任何可收集布里渊散射光的胚胎组织。发育过程是非常多样的，单一类型的成像只能提供有限的信息。以上部分成像方式虽存在相似的功能但各有优势，所以将不同的成像方式结合在一起的多模态成像方法

参考文献： ［1］ SHANG WANG， IRINA V． LARINA， KIRILL V． LARIN． Label－free optical imaging in developmental biology ［Invited］ ［J］． Biomedical Optics Express． 2020， 11（4）： 2017～2040． ［2］ Drexler W， et al． Optical coherence tomography today： speed， contrast， and multimodality． J Biomed Opt． 2014；19（7）：071412． ［3］ K． Karnowski， A． Ajduk， B． Wieloch， S． Tamborski， K． Krawiec， M． Wojtkowski， and M． Szkulmowski， “Optical coherence microscopy as a novel， non－invasive method for the 4D live imaging of early mammalian embryos，” Sci． Rep． 7（1）， 4165 （2017）． ［4］ Pahlm O， Wagner GS： Multimodal Cardiovascular Imaging： Principles and Clinical Applications： www．accessmedicine．com ［5］ Wikipedia． https：／／en．wikipedia．org／wiki／Photoacoustic＿imaging．