实验方法原理 大多MDR细胞膜上出现MDR-1基因及其基因产物P-糖蛋白过度表达。
实验材料 RNA
试剂、试剂盒 PBS氯仿异丙醇萘酸异硫氰酸肽十二烷基肌酸钠构橼酸钠乙酸钠二疏基乙醇乙醇Taq酶
仪器、耗材 离心机紫外分光光度计琼脂糖凝胶电泳PCR仪
实验步骤
一、细胞总RNA提取
1. 收集约5×107个细胞，冷PBS洗涤。
2. 加入400 ul RNA提取液（含6 mol/l 的异硫氰酸肽，0.5%十二烷基肌酸钠，0.025 mol/l 构橼酸钠pH7.0，0.25 mol/l 乙酸钠，pH4.0，0.5%二疏基乙醇，50%萘酸），混匀。
3. 加入400 ul 氯仿，混匀，以13 000 r/min 于4℃离心15 min。
4. 取上清液加入等体积的异丙醇，4℃放置30 min。
5. 然后以13 000 r/min 离心15 min，吸上清，将RNA成点用75%的乙醇洗涤1次，溶于100 ul 的无菌双蒸馏水中。
6. 并用紫外分光光度计检测RNA纯度（A260/A280应为1.8~2.0）后备用。
二、反转录及PCR扩增
引物
2. 取细胞总RNA10 ul 加入20 ul AMV逆转录酶反应体系中，42℃保温30 min 进行反转录，合成cDNA。
3. 然后置95℃，3 min 终止反转录。
4. 接着在Taq酶的作用下，用mdr-1和β2-MG引物，对cDNA上的目的片段进行PCR
5. 94℃预变性2 min，然后94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，扩增35个循环。
6. 最终在60℃保温7 min，以保证产物充分延伸。
7. 取10 ul 扩增产物在3%琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下照相，与mdr-1 cDNA阳性对照，等位的DNA条带为阳性，反之为阴性。
