多重端粒荧光原位杂交实验

永生化淋巴细胞株

青霉素谷氨酰胺胎牛血清植物血球凝集素胸苷秋水仙胺KCl甲醇冰乙酸柠檬酸钠SSC甘油生物素-16-dUTP地高辛-11- dUTP10 XdNTP 混合物

超净台细胞培养瓶Nunc 管培养基相差显微镜染色缸加热板装有Pinkel滤光片轮的CCD显微镜Chromoprobe Multiprobe®-T 试剂盒恒温摇床氨苄青霉素卡那霉素氯霉素LB琼脂平板2 X YT 培养基

一、固定的中期染色体细胞悬液的制备

（1）外周血样品

1.37℃水浴锅内预热RPMI-1640培养基、FCS、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素。

2.在二级细胞培养用超净台中，无菌条件下配制完全培μ基：100mL FCS、5mL L-谷氨酰胺、5mL青霉素/链霉素，加RPMI-1640至500ml。3.在2个Nunc培养管中，各加0.25mL外周血、5mL完全培养基、PHA(终浓度2%)。

4.37℃培养箱中孵育72h。

5.加10OpL15mg/mL的胸苷到每个培养物中，轻轻混匀。

6.37℃培养箱中孵育16〜18h。

7.180g离心5min。

8.弃上清，用5mL完全培养重悬细胞。

9.180g离心5min。

10.弃上清，用5mL完全培养重悬细胞团块。

11.37℃条件下孵育5h。

12.加100/×L10jLtg/mLKaryoMa×秋水酰胺。

13.37℃条件下孵育10min。

14.180g•离心5min。

15.弃上清，用37℃预热的7mL0.075mol/L KCl悬起细胞团块。

16.37℃条件下孵育15min。

17.180g离心5min。

18.弃上清。

19.将管子放在涡旋振荡器上以中速振荡，缓慢滴加预冷的甲醇：冰乙酸(3:1)固定液到细胞中。当细胞悬液变成褐色时，加速滴加固定液，至总体积5mL。

20.180g离心5min，弃上清。

21.加5mL预冷的固定液。

22.180g•离心5min，弃上清。

23.加5mL预冷的固定液。

24.180g离心5min，弃上清。

25.加3mL预冷的固定液重悬细胞。

26.储存在-20℃条件下备用。

（2）来自永生化淋巴细胞株

1.增殖细胞，直至全培基到50mL。.

2.收获细胞前的18〜24h，更换新鲜培养液。

3.收获时，将20mL生长良好的细胞移到50mL离心管中。

4.加200ΜL浓度为10μ×g/mL秋水酰胺，轻轻混匀。

5.37℃条件下孵育50〜60min。

6.180g离心5min。箱或水浴箱)。

5.预热Multiprobe®装置，探针面朝上（即突出表面朝上，标记表面朝下），不要接触突出方形块的表面。

6.准备一个染色缸装2×SSC，三个染色缸分别装70%、85%和100%的乙醇系列。

7.用2×SSC洗点好样的片子2min，然后依次在70%、85%和100%的乙醇中各脱水2min。

8.片子空气干燥后，有样品一面朝上的放在37℃加热板上。

9.同时，用10斗移液器取2,预热杂交液点到Multiprobe®装置上的突出方形块上（放置在37℃加热块上）。

10.小心翻转片子（点样品面朝下），使之与Multiprobe®装置上相应的方块接触，组装到Multiprobe®装置上;也就是方块1在Multiprobe®装置的最右上角。

11.小心地提起组装好的装置，翻转使片子在Multiprobe®装置的下面。

12.放在37℃加热板上10min。

13.将组装好的装置保持水平小心地转移到75℃加热板上。

14.变性1〜3min，变性时间取决于固定的染色体悬液时间长短。

15.立即转移组装好的装置到预热的ChromoprobeMultiprobe®杂交室（或者避光塑料玻片盒）中，更换盖子，然后在去盖的水浴锅中过夜。

二、

（4）杂交后洗脱和封片

1.将洗脱液I倒入干净的染色缸中，水浴中预温至72℃后，调整pH至7.0。

2.将洗脱液II倒入干净的染色缸中，室温（20〜25℃)放置。

3.从杂交室中取出组装好的Multiprobe®装置。

4.小心卸下Multiprobe®装置，立即将片子放在洗脱液I中2min，用镊子

夹住片子，轻轻的上下振荡。

5.转移到洗脱液II中30s。

6.夹住片子的长边，在纸上沥去过量液体10〜20s，但注意玻片表面不能干。

7.加20μL含DAPI的抗淬灭剂溶液到盖玻片（24mm×60mm，试剂盒中提供）的两端，轻轻地将片子上的杂交区域压到盖玻片上。

8.检查复染的区域，用钝头镊子轻轻按压排掉气泡。

9.将吸水纸盖在标本上方，轻轻按压以除去过量的液体。

10.将指甲油涂在盖玻片周围来封片。

11.观察前至少在黑盒或玻片夹中放置至少10min以备阅片。

（5）荧光显微镜下分析杂交后的片子

1.将标本放在显微镜载物台上。

2.使用10倍的物镜和DAPI滤光片观察第一方块，观察单个细胞的中期染色体。

3.加镜油到方形块，转换成100倍的油镜。

4.转换到三通滤光片（DAPI/FITC/德克萨斯红）观察中期染色体。

5.计数绿色短臂信号和长臂红色端粒信号，并记录染色体的位置。第一方块的正常实验结果是1号染色体上有两个绿色信号在短臂端粒区，两个红色信号在长臂端粒区。

6.分别用FITC滤光片或德克萨斯红滤光片确认实验结果。

7.重复步骤2〜6,直到该孔中不同的5个中期分裂相均得到明确的结果。

8.每个孔的检测都重复步骤2〜7。

9.记录分析结果，任何不正常的结果或者某些探针杂交结果不满意时，应该用这些探针重做杂交实验。

10.确认异常时采用患者的新鲜样本，可能的话同时分析父母样本，这样将有助于判定异常是否是真异常（如果为真异常的话，确定是原发的还是家族遗传的），还是良性多态变异的结果。

三、端粒克隆DNA的抽提

1.准备含特定抗生素50μg/mL氨苄青霉素、35μg/mL卡那霉素或12.5μg/mL氯霉素）的LB平板。

2.从-70℃取出甘油保存管，放在干冰上。

3.取甘油保存的菌种在LB平板划线后，37℃细菌培养箱培养过夜。

4.加100mL 2×YT培养基到500mL离心管中，按步骤1所示浓度加抗生素。

5.从平板上挑选单克隆接种到2×YT培养基，37℃摇床中培养过夜。

6.取700μL细菌培养物加300μL100%甘油混合均匀，分装在两个Eppendorf管中，标记好，-70℃条件下保存。

7.剩余的细菌培养物350g离心15min。

8.弃上清，将离心管倒扣在纸上沥干。

9.用30mL冷的细胞重悬液悬起沉淀，剧烈混匀和抽吸几次，使得小细胞团块彻底悬起10.加30mL细胞裂解液，上下轻轻颠倒一次。

11.室温放置5min(不要延长时间）。

12.立即加30mL冷的中和液，上下轻轻颠倒混匀。

13.冰上放置15min，每5min上下颠倒几次。

14.4℃下4000g•离心40min。

15.标记好一个新的250mL离心管，上面放一个塑料漏斗。

16.剪一个圆形的杂交网筛，中间剪开一个裂缝，装到漏斗上。

17.小心将离心的上清倒在网筛上，液体经过网筛和漏斗收集到250mL离心管里，注意不要有絮状物穿过网筛。

18.移去漏斗、网筛，用水、乙醇清洗以备下次使用。

19.加0.7倍体积的无水异丙醇沉淀DNA。

20.混合均匀，4000g离心10min。

21.弃上清，加入25mL70%乙醇。

22.振荡混匀，4000g离心10min。

23.弃上清，将离心管倒扣在纸上以去掉多余液体。

24.用1mL TE(pH8.0)重悬DNA沉淀。

25．取5μL抽提的DNA在0.9%的凝胶上电泳检测，用Xmnd III DNA作

为参考标准，完整的黏粒大小应该在大分子质量的位置。

26.测量抽提的DNA浓度（如使用荧光光度计)。

27.在-20℃储存抽提的DNA。

四、用缺口平移法间接标记端粒克隆DNA

1.将Eppendorf管放在冰上，然后加入1.0μg待标记DNA、1.2μL生物素-16-dUTP(如果标记短臂探针）或地高辛-11-dUTP(如标记长臂探针）等，加蒸馏水至总体积50μL。

2.轻轻振荡，稍离心以去气泡。

3.在15℃水浴中反应90min。

4.将反应体系放在冰上暂停反应。

5.取5μL在2%的琼脂糖凝胶上检测片段大小，用Phi×174作为DNA大小的参考标准。

6.最适于杂交的片段大小为50〜500bp条带。如果片段大于500bp，则补加1.0μL DNase I，15℃孵育30min

7.当探针大小合适时，用装有交联葡聚糖G50的SELECT-B离心柱过柱去掉未结合的核苷酸。

8.加25μL鲑鱼精DNA(若标记的探针超过1哗，则按比例增加鲑鱼精DNA。

9.加蒸馏水调整探针浓度为10ng/μL(应扣除已用于检测的探针量）。

10.记录10ng/μL探针混合物的体积。

11.每微升探针混合物加入适量的人Cot-1DNA[加入量依据探针和原始插入的片段大小而定。

12.计算好含120ng探针的人Cot-1DNA/探针混合物的体积，按体积取出移到新的Eppendorf管中。

13.在真空离心机中离心干燥Cot-1DNA/探针混合物（注意不要过于干燥)。

14.为了获得某染色体长短臂端粒特异性探针杂交液混合物，将Cot-1DNA/长臂或短臂探针混合物分别重悬在38μL杂交液中，两者合并成76μL杂交液。

15.若制备单独检测长臂或短臂端粒的探针，则将Cot-1DNA/探针混合物直接重悬在76uL杂交液中。

16．混匀后在-20℃条件下储存。

五、间接标记探针的杂交和杂交后处理

（1）杂交

1.打开加热板，调整温度到75℃并预热。

2.取18斗探针杂交液到Eppendorf管，并预热到37℃(水浴锅或加热

板)。

3.按照3.2.1中所示方法调整细胞悬液至最佳浓度。

4.将高质量显微载玻片浸泡在无水甲醇中2min。

5.用干净的软纸擦干片子。

6.将10〜20；×L调整好浓度的细胞悬液滴加到载玻片的中央。

7.将标本放置干燥，用相差显微镜的1〇倍物镜检查标本的质量。

8.在磨砂处标记实验内容，用钻石笔在载玻片背面划定样品区域。

9.准备一个染色缸装2×SSC，三个染色缸依次装70%、85%和100%的乙醇。

10.将制备好的片子（用固定的细胞悬液点样）用2×SSC洗2min，然后依次在70%、85%和100%的乙醇中各脱水2min。

11.片子空气干燥后，有样品一面朝上放在37℃加热板上12.轻轻上下抽吸混匀预热的杂交液，小心不要产生气泡。

13.吸取杂交液加到钻石笔划定区域的中央。

14.小心地将一个22mm×22mm盖玻片盖到杂交液，用钝头镊子轻轻按压排掉气泡。

15.小心地将片子（盖玻片一面朝上）放在75℃加热板上。

16.变性、1〜3min，变性时间取决于细胞悬液的老化程度

17.变性后立即转移到预热的避光塑料玻片盒中，37℃水浴中杂交过夜（水浴锅不盖盖子）。

（2）杂交后洗脱、抗体检测和复染

1.准备封闭液和抗体溶液1〜3。

2.振荡抗体溶液，在微型离心机中以最大转速离心10min。避光放置，如有必要可在室温中预温。

3.加洗脱液I到干净的染色缸中，水浴中预温到72℃后调整pH至7.0。

4．加洗脱液II到干净的染色缸中，室温（20〜25℃)放置。

5.同时将用水湿润的吸水纸放在一个空的避光塑料玻片盒（如空的玻片盒）的底部。

6.用剪刀为每个标本准备4张大小约为22mm×64mm的封口膜。

7.从避光塑料盒中取出标本，在纸上快速去掉盖玻片。

8.立即将片子放在洗脱液I中2min，用镊子夹住片子，轻轻的上下振荡。

9.转移到洗脱液n中30s。

10.夹住片子的长边，在纸上沥去过量液体10〜20s，注意不要使片子表面过于干燥。

11.将片子架到预先准备好的避光塑料玻片盒子中（如玻片两端搭在玻璃棒上或盒子底部平台上），取300μL封闭液加到片子上，用封口膜覆盖，避免产生气泡。

12.盖上玻片盒盖子，37℃温箱中孵育40〜50min。

13.37℃预热1.5LST缓冲液。•

14.孵育完成后去掉封口膜，将片子放在标本架上浸泡在预热的ST缓冲液中。

15.放在摇床平台上振荡3min，将倒置的避光容器放在上面保持暗环境。

16.按步骤10所示方法沥去标本上的过量液体。

17.将片子放到避光塑料玻片盒中架子上，取80μL抗体溶液1加到杂交区域。

18.用封口膜覆盖，避免产生气泡

19.盖上盖子，37℃温箱中孵育10min。

20.去掉封口膜，将片子放在标本架上浸泡在预热的ST缓冲液。

21.放在摇床平台上避光振荡3min。•

22.倒掉原来的ST缓冲液，更换新的预热ST缓冲液。

23.重复2次步骤21和22。

24.洗完3次后，按步骤10所示方法沥去过量液体。

25.将片子放到塑料避光容器中架子上，取5OμL抗体溶液2加到杂交区域。

26.用封口膜覆盖，避免产生气泡。

27.盖上盖子，37℃温箱中孵育10min。

28.去掉封口膜，在热的新ST缓冲液中洗3次，每次3min。

29.将片子按步骤10所示沥去过量液体。

30.将片子放到塑料避光容器中架子上，取80μL抗体溶液3加到杂交区域。

31.盖上盖子，37℃温箱中孵育10min。

32.去掉封口膜，在热的新ST缓冲液洗3次，每次3min。

33.在最后ST缓冲液洗脱过程中，加大约25μLDAPI复染液到放在纸上的22mm×22mm盖玻片上。

34.将片子按步骤10所示沥去过量液体。

35.轻轻地将片子的杂交区域倒扣到加有DAPI复染液的盖玻片上。

36.将吸水纸盖在标本上方，轻轻按压以除去过量的复染液。

37.检查复染的区域，用钝头镊子轻轻按压排掉气泡。

38.将指甲油涂在盖玻片周围来封片。

39.按二、（5）中所示方法避光放置至干燥后用荧光显微镜观察。