女院士最新JBC解析两个相对发现

　　来自上海生科院生化与细胞所的研究人员获得了亮氨酰-tRNA合成酶的最新成果：他们发现原核生物中亮氨酰-tRNA合成酶依赖tRNA的转移前编校。这一研究成果公布在《J Biol Chem》杂志上。

　　领导这一研究的是生化与细胞所王恩多院士，其从事生物化学与分子生物学研究，研究方向为酶与核酸的相互作用。目前主要以氨基酰-tRNA合成酶和相关tRNA为对象进行研究。

　　氨基酰-tRNA合成酶(aaRS)催化对应氨基酸和tRNA之间的连接反应，生成氨基酰-tRNA为蛋白质的生物合成提供原料。aaRS必需精确地识别其对应的氨基酸，否则将会生成错误的氨基酰-tRNA，使新合成的蛋白质一级结构发生改变，导致细胞病变。为了提高蛋白质生物合成的精确性，某些aaRS进化出编校功能(proofreading/editing)去除在识别氨基酸时发生的错误。

　　在之前的研究中，王恩多实验室证明亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)具有转移后和不依赖tRNA转移前的编校功能。他们发现进化树底部的超嗜热菌 Aquifex aeolicus 的LeuRS (AaLeuRS) 具有不依赖tRNA的转移前编校活力，可以直接水解被AaLeuRS误活化的氨基酸。其活性中心不在CP1结构域，而在氨基酰化活性中心，AaLeuRS催化误活化氨基酸的水解速度远高于误活化氨基酸自发水解的速度。这项研究的意义在于发现：LeuRS的氨基酰化活性中心除了通过氨基酸的分子大小来“粗筛”氨基酸底物以外，还具有对反应中间体的“细筛”功能，进而揭示了AARS催化反应的精确性是多层次、多结构域共同协同作用的结果。

　　而最新的研究则发现原核生物中亮氨酰-tRNA合成酶依赖tRNA的转移前编校。研究人员利用点突变和最近开发的LeuRS的小分子抑制剂AN2690，证明了大肠杆菌(E. coli)和超嗜热菌(A. aeolicus)的LeuRS具有依赖tRNA的转移前编校，分析了不同的编校途径在编校过程中发挥的具体作用。研究结果表明，转移前编校(pre-transfer editing)和转移后编校(post-transfer editing)协同控制LeuRS的质量控制步骤;但EcLeuRS更偏向转移后编校途径，而AaLeuRS更偏向于转移前编校。

　　研究结果还表明，tRNALeu的3’CCA末端结合到CP1编校结构域中是LeuRS依赖tRNA进行转移前编校的先决条件;无论能否执行转移后编校，tRNA处于转移后编校的构象是赋予LeuRS转移前编校能力的必要条件;另外，依赖tRNA的转移前编校途径不受AN2690的抑制。

　　王恩多实验室对LeuRS的编校途径的系统研究表明aaRS在催化反应的每一步都具有检查点(Check point)去除错误氨基酸，进行质量控制，保证蛋白质生物合成的精确性。

　　原文检索：

　　tRNA-dependent Pre-transfer Editing by Prokaryotic Leucyl-tRNA Synthetase

　　To prevent genetic code ambiguity due to misincorporation of amino acids into proteins, aminoacyl-tRNA synthetases have evolved editing activities to eliminate intermediate or final non-cognate products. In this work we studied the different editing pathways of class Ia leucyl-tRNA synthetase (LeuRS). Different mutations and experimental conditions were used to decipher the editing mechanism, including the recently developed compound AN2690 that targets the post-transfer editing site of LeuRS. The study emphasizes the crucial importance of tRNA for the pre- and post-transfer editing catalysis. Both reactions have comparable efficiencies in prokaryotic Aquifex aeolicus and Escherichia coli LeuRSs, although the E. coli enzyme favors post-transfer editing, whereas the A. aeolicus enzyme favors pre-transfer editing. Our results also indicate that the entry of the CCA-acceptor end of tRNA in the editing domain is strictly required for tRNA-dependent pre-transfer editing. Surprisingly, this editing reaction was resistant to AN2690, which inactivates the enzyme by forming a covalent adduct with tRNALeu in the post-transfer editing site. Taken together, these data suggest that the binding of tRNA in the post-transfer editing conformation confers to the enzyme the capacity for pre-transfer editing catalysis, regardless of its capacity to catalyze post-transfer editing.

　　作者简介：

　　王恩多

　　研究员，博士生导师。

　　1965-1969和1978-1981两次中国科学院上海生物化学研究所研究生毕业。

　　1984-1987年在美国加州大学戴维斯分校医学院访问，

　　1992年10-12月，1994年10-12月，1998年1-4月在法国斯特拉丝堡法国国家科学研究中心分子与细胞研究所合作研究，

　　1996年9月-1997年2月在香港科学技术大学生物化学系进行研究工作，

　　2000年6-8月在加拿大Laval大学生物化学系，进行合作研究。

　　为中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所学位评定委员会委员。从事生物化学与分子生物学研究，研究方向为酶与核酸的相互作用。目前主要以氨基酰-tRNA合成酶和相关tRNA为对象进行研究。已主持和承担国家和中国科学院重大和重点研究项目14项。发表论文80余篇，申请发明专利4项，以第一完成人获得2000年度上海市科学技术进步奖一等奖1项，2001年度国家自然科学奖二等奖1项。已指导和培养博士研究生16名，硕士生3名，所培养的研究生获得包括中国科学院院长奖学金的各类奖项20人次。曾多次获得上海市“三八红旗手”、2000年度上海市“三八红旗手标兵”、1998-2000年度上海市劳动模范称号。

,

　　研究简介

　　研究方向为酶与核酸的相互作用，氨基酰-tRNA合成酶是蛋白质生物合成过程中的一类关键酶。它催化蛋白质生物合成过程中的第一步反应-tRNA的氨基酰化反应。氨基酰-tRNA合成酶对tRNA的精确识别保证了遗传信息由核酸传递到蛋白质的精确性。 所以研究氨基酰-tRNA合成酶具有重要的生物学意义。随着研究的深入，氨基酰-tRNA合成酶还可以为人类的疾病防止和治疗、改善人类生存环境提供理论依据和新的思路。本研究组用分子生物学、生物化学与生物物理方法，从基因克隆、高表达和突变入手，研究不同来源的亮氨酰-和精氨酰-tRNA合成酶(LeuRS, ArgRS)及其相关tRNA的相互作用。重点研究酶分子上与相关tRNA精确相互作用的氨基酸残基和结构域，这种精确识别包括合成正确产物和校正错误的中间产物和终产物的催化机制;tRNA分子上与酶精确识别的硷基;不同来源的同种氨基酰-tRNA合成酶对抑制剂的选择性。以了解酶与tRNA相互作用与精确识别的结构基础和作用机理。过去的研究结果有：通过基因定点研究了ArgRS与氨基酰化活力有关的重要的氨基酸残基;首次发现大肠杆菌tRNAArg2分子上的A20是大肠杆菌ArgRS识别tRNA的重要元件;首次结晶了大肠杆菌ArgRS，解出了晶胞参数，对晶体进行了初步研究;用核磁共振方法研究了ArgRS与底物结合时引起的构象变化。首次发现并证明LeuRS的CP1结构域内的292E和293A间的肽键对酶活力至关重要; 首次发现LeuRS的292E-293A肽键间插入253-292之间40个氨基酸残基的插入突变变种LeuRS-A催化tRNALeu2亮氨酰化的速度为tRNALeu1的3倍，证明了LeuRS-A对tRNALeu等受体的识别是对接受茎上第一对碱基对是否为摆动碱基对的识别;首次发现LeuRS的CP1是编校活性中心所在，某些在该结构域的变种也可以不同程度误氨基酰化tRNALeu的等受体。研究结果多次被《生物化学年鉴》和《细胞》中的综述，《美国科学院院报》，《欧洲分子生物学组织杂志》和《生物化学》的研究论文引用。研究组与法国，加拿大，美国等多家实验室有合作研究关系。