平板细胞克隆形成试验
实验方法原理 | 克隆形成试验是测定细胞增殖能力的有效方法之一,贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆,而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。细胞克隆形成率表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量,可以反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。 |
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实验材料 | 细胞样品 |
试剂、试剂盒 | 胰蛋白酶 胎牛血清 DMEM培养液 PBS 多聚甲醛 GIMSA染液 |
仪器、耗材 | 培养皿 培养箱 显微镜 |
实验步骤 |
1、取对数生长期的各组细胞,分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。 2、将细胞悬液作梯度倍数稀释,每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀。置37℃ 5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2——3周。 3、经常观察,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去上清液,用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液,加适量GIMSA应用染色液染10——30分钟,然后用流水缓慢洗去染色液,空气干燥。 4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,用肉眼直接计数克隆,或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。
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注意事项 |
1. 试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好,不能有细胞团,接种密度不能过大。 2. 细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度,否则结果的准确度会受到很大影响。
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其他 |
1. 克隆形成率公式:克隆形成率 =(克隆数/接种细胞数)×100% ,细胞克隆形成率即细胞接种存活率,表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。 2. 一般初代培养细胞克隆形成率弱,传代细胞系强;二倍体细胞克隆形成率弱,转化细胞系强;正常细胞克隆形成率弱,肿瘤细胞强。
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