微流控系统中毛细管电泳（CE）分离技术

1. 前言

微流控芯片是以微管道为网络连接微泵、微阀、微储液器、微电极、微检测元件等既有光、电和流体输送功能的元件，最大限度地把采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等分析功能集成在芯片上的微全分析系统。

微流控芯片（Microfluidic Analysis）是微分析系统的主要组成部分，它与生物芯片（Biochips）或微阵列芯片（Microarray chips）统属LOC系统。但是生物芯片与微流控芯片涉及的是两个完全不同的学科技术领域，并经历了各自独立的发展过程。因生物芯片的应用对象主要是DNA分析，所以也称为DNA芯片，其发展要早于微流控芯片4-5年，始于80年代末。其发展主要来自与现代遗传学的一些重要发现，并直接受益于该领域的某些重要研究成果。微流控芯片则是90 年代初、中期主要在分析化学领域发展起来的，它以分析化学为基础，以微机电加工技术为依托，以微管道网络为结构特征，以生命科学为目前主要应用对象，是当前微全分析系统领域发展的重点。它的目标是把整个化学实验室的功能集成在微芯片上，且可多次使用。两者之间是互补与互融合的关系。

九十年代至今，国内外学者在微流控芯片上样品的分离方面上做了大量的研究，但多数研究主要集中在毛细管电泳方面，其它分离技术涉及较少。微流控芯片上的毛细管电泳（CE）微分离技术已成为当今研究的热门。由于CE属于电场驱动的微管分离，且进样也能够通过电场实现，因此相应的技术和装置就比较轻易微型化，实验条件在微型化后变化也不大，轻易移植。所以从1991年至今，国际上在其制作工艺方面的进展与其在生物和化学方面快速分析的应用也充分表明了毛细管电泳在微型化上的潜力和可行性。

2．毛细管电泳（CE）分离技术
电泳作为一种物理现象早在19世纪就被人们所熟悉，电泳作为分离技术始于本世纪初。1907年，Field和Teague利用琼脂糖凝胶管实现了白喉毒素和抗毒素的分离。1923年Kendall在琼脂糖凝胶U型管内对同位素进行了分离。1937年Tiselius建立了蛋白质的移界电泳方法，将人血清分成几个成分，因此荣获了Noble化学奖。
电泳是电介质中带电粒子在电场作用下以不同速度向电荷相反方向迁移的现象，利用这种现象对化学或生物组分进行分析分离的技术称之为电泳技术。毛细管电泳泛指在极细的毛细管内实现的一大类电泳技术。几十年来毛细管电泳作为一种非常重要的分离技术已对生命科学的各个领域的发展起到了极其重要的作用。96根阵列毛细管电泳的实用化大大加快了举世瞩目的人类基因工程的进程，使之由原定的2005年提前到2000年基本完成。
CE是从70年代末发展起来的一项新的分析技术，首先在氨基酸、多肽、蛋白质及核酸等生物大分子的分离分析方面得到应用。由于CE具有进样体积小（10um）、样品分析范围宽、分离效率高（柱效可达100万塔板数）、分离速度快（<10-- 20min）、检出极限（< 10-15----1028mol/l）、易实现自动化、仪器价格低等特点，它的出现和发展受到广泛关注。
2．1 CE的装置
CE的基本装置包括高压电源、毛细管、柱上检测器、供毛细管两端插进又和电源相连的两个储液瓶 。

2．2基本原理
    毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，根据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异来进行分离的一类液相分离技术。
    CE所用的石英毛细管在PH>3时，其内表面带负电，和溶液接触形成一双电层。在高压作用下，双电层中的水合阳离子层引起溶液在毛细管内整体向负极活动，形成电渗流。同时，带电离子在电场作用下，以不同 的速度向其相反的方向迁移的现象称为电泳。带电粒子在毛细管内电解质溶液中的迁移速度即是电泳和电渗流的矢量和。

按毛细管内分离介质和分离原理的不同，现可将其分为六种模式：
（1）毛细管区带电泳(CZE)
    它是基于被分离物质的核质比间的差异来进行的分离。即它只能分离带电物质，而不能分离中性分子。
（2）毛细管凝胶电泳(CGE)
    它是用凝胶作为毛细管中的支持物，起到分子筛的作用，将不同体积的溶质分子分离开。该法是所有CE中柱效最高的一种分离方法。在DNA的解析分离中曾采用。
（3）毛细管胶束电动色谱(MECC)
    采用表面活性剂在运动缓冲液中形成一疏水内核、外部带负电的动态胶束相，利用溶质具有不同的疏水性，在水相和胶束相间分配的差异进行分离。它即可分离中性组分也可分离带电组分。
（4）毛细管等电聚焦(CIEF)
  根据两性电解质在毛细管内建立PH梯度，使各具有不同等电点的蛋白质在电场作用下迁移到等电点的位置，形成窄的聚焦区带。该法以成功的测试了蛋白质、氨基酸、肽等电点，分离异构体。
（5）毛细管等速电泳(CITP)
    该法采用先导电解质和尾随电解质，按待测组分的电泳淌度不同得以分离。
（6）毛细管电色谱(CEC)
    该法是将HPLC中从多的固体微粒填充到毛细管中，以样品与固定相之间的相互作用为分离机制，以电渗流为相驱动力的色谱过程。该法比一般的HPLC分离度高，常用于分离小分子。
2．3 毛细管电泳的优点
（1）仪器简单、便于自动化
    与HPLC仪相比，CE仪省往泵、梯度混合装置和进样阀，不需要特殊的检测池，这样，CE仪的构成就非常简单。最基本的配置只需一个高压电源、一根毛细管、两只缓冲槽和一个检测器及记录仪。
（2）分离模式多样化
    CE的多种不同的操纵方式都可以在同一台CE仪上实现，可以针对不同的分析对象，选择BGE及毛细管内填充物和分离模式。
（3）分离效率高、速度快
    由于CE使用的细管径毛细管散热和抑制对流的能力强，所以可以施加比传统电泳高得多的电压，反而进步了分离效率，缩短了分析时间。
（4）应用范围广
    CE具有多种分离方式且往往结合了电泳和色谱的分离机制，应用范围极为广泛。在简单离子和小分子化合物（包括中性分子）的分离分析方面可以与HPLC相媲美，在生物大分子分析方面CE则略占上风，而且它与HPLC所提供的信息是不同的，可以互相补充。
（5）分析本钱低
    CE使用的石英毛细管可以反复使用。其体积只有几uL，分析过程中的体积速度又很小，不象HPLC必须消耗大量的溶剂。使用的BGE浓度很低。
（6）样品消耗少
    CE的柱容量低，必须保持较小的进样体积（ <20nL）和较低的样品浓度(10-6--10-5mol/L)以防超载，所以样品的消耗少，每次实际进样量在ng以下。对于分析珍贵的样品，如基因工程产品极为有利。
（7）方法建立比较简单
    由于目前CE多在开管方式下进行，一般只需进行BGE种类、浓度和PH以及添加剂的选择和优化。操纵模式的更换也比较方便。
（8）样品预处理比较简单
    CE多使用开管柱，不必担心柱污染。对一些生化样品可以直接进样、对样品预处理远比HPLC简单、对稀样品有时可以在进样过程中浓缩和富集。

3．芯片上CE生物样品的分离
芯片上的CE是在常规CE原理和技术的基础上，利用微型制造技术在平方厘米级大小的芯片上刻蚀出扁平的管道和其它功能单元，通过不同的管道网络的设计和布局，实现样品的分离分离技术。
微流控芯片电泳可以用于分离包括DNA、蛋白质、糖和各种小分子在内的不同对象，并将会用于药物筛选、临床诊断、功能基因分析、细胞计数等领域。芯片电泳潜伏本钱低、体积小、速度快、易于实现高通量。本文的样品涉及到以下几个方面：
3．1 单核苷酸多态性及临床应用

林柄承等根据毛细管筛分电泳中不同筛分介质，同一筛分介质中不同浓度以及不同添加剂对DNA分离的影响，对以羟丙基甲基纤维素为基础的筛分截止进行研究，并予改进和优化。考察了甘露醇、葡萄糖等不同添加剂对筛分能力的影响，开发了一系列全新的，以甘露醇添加剂为特征，具有超低粘度和高分辨率的毛细管电泳无胶筛分介质。对毛细管电泳在医学基因诊断的各个相关领域中的应用进行了较为系统的、有一定覆盖面的研究。和协和医院合作研究的结果表明，所发展的毛细管电泳无胶筛分介质已能够较为普遍地应用于基因突变的检测和基因的家系连锁分析，代表性的工作是苯丙酮尿症（PKU）。
3．2 蛋白质分析
蛋白质研究的典型做法是：用液相色谱收集蛋白质，用二维电泳对蛋白质作双向分离，把分离带刮下，酶解，再用毛细管电泳作肽图，然后通过毛细管电泳—质谱作肽序列测定并将所得的数据和已有数据库内的数据对照。要对细胞内的所有蛋白质作这样的测定是一项工作量不下于人类基因组工程的巨大工程，需要世界范围内朝野一致的努力。林柄承等[3]开展了对抗乙肝抗体、人血胃泌素、脑垂体组织培养液中的蛋白质，以及干扰素等进行分析，并进一步把这方面的工作扩大到血液代制品，为人类蛋白质组工程积累了经验。
3．3 蛋白质和其它分子的相互作用
用不同的亲和毛细管电泳、手性毛细管电泳和其它电泳模式系统研究了蛋白质-单一大分子配体、蛋白质-单一小分子配体，以及蛋白质-一个以上小分子配体之间的相互作用，其中包括tRNA合成酶和tRNA、凝集素-糖、血清蛋白-铁、血清蛋白-血红素、人血清白蛋白（HAS）-卟啉以及人血清白蛋白-多元手性药物的相互作用。在对后者的研究中，观察到了药物之间的顶替和协同作用。
3．4 单分子
   芯片电泳技术正和快素发展的激光诱导荧光（LIF）、电子偶合器件（CCD ）等技术相结合逼近人类熟悉的另一个重要极限。在单分子层面上对不同物质实行分离检测。将芯片电泳与单分子检测技术结合，更重要的是给单分子检测引进一种机器重要的分离手段，不但毛细管电泳的知识积累可以转移到单分子水平上重新熟悉，也使芯片电泳技术拥有更广阔的应用远景，尤其在生物几医学领域。
4．毛细管电泳的发展趋势
21世纪将是生命科学大发展的世纪，chip是将CE发展的一个重要趋势，将一个实验室的工作集成到一块很小的芯片上，是仪器微型化。另一方面，96支或更多支毛细管阵列电泳仪将会用于药厂中产品质量检验及大量医学临床。将会研制适合CE用的各种检测器，以进行但细胞和单分子的检测。此外，CE在环境科学中也会有较大的发展余地。