微生物基本技术操作要求！

一、无菌操作要求

微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多实验要求在无菌的条件下进行，主要原因，一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。要求如下：

1.1  接种细菌时必须穿工作服、带工作帽；

1.2  进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用；

1.3  接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用酒精棉球将手擦干净；

1.4  进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用酒精点燃烧灼三次后使用；

1.5  从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及试管或平皿边；

1.6  接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌活样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒；

1.7  接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到针和环与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼；

1.8  吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。

二、无菌间使用要求

2.1 无菌间应密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及门，另尽量设有的小窗，以备进入无菌间后传递物品。

2.2  无菌间应保持清洁，工作后用煤酚皂液溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与试验无关的物品；

2.3  无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬掉紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离工作台1m处，照射时间不少于30分钟，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精球轻轻擦拭，除去上面的灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响；

2.4  处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递；

2.5  在无菌间需用安装空调时，则应有过滤装置。

三、消毒灭菌要求

微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。

3.1  灭菌前准备

3.1.1  所有需经灭菌的物品首先要清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面气孔打开。

3.1.2  装培养基的三角瓶塞好棉塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。

3.2  装放

3.2.1  大型高压蒸气锅：放置灭菌物品不应超过锅内容积的80%，物品应放置锅内搁架上或铁丝筐中。

3.2.2  手提式高压锅：将物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。

3.3  设备检查

3.3.1  检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。

3.3.2  压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞。

3.3.3  对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否符合于进行灭菌处理的要求。

3.4  灭菌处理

手提式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行：

3.4.1  手提式高压锅在主体内加入3L清水，立式高压锅加水16L（重复使用时应将水量补足，水变混浊需要更换）。

3.4.2  手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中（无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用）。

3.4.3  盖好顶盖拧紧，勿使漏气；置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通上电源，并打开顶盖上的排气阀放出冷气（水沸腾后排气10～15min）。

3.4.4  关闭排气阀，使蒸气压上升到规定要求，并维持规定时间（按灭菌物品性质与有关情况而定）。

3.4.5  达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸汽，待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下再打开盖取物，以防止突然减压液体剧烈沸腾活容器爆破。

3.5 灭菌温度与时间

3.5.1压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间见下表：

3.5.3  取出的物品掉落在地或误放不洁之处，或沾有水液，均视为受到污染，不可作为无菌物品使用。3.5.2  灭菌处理：灭菌后物品，剂等，应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态，未达到者应废弃。

3.5.4  取出的合格灭菌物品，应存放于贮藏室或防尘柜内，严禁与未灭菌物品混放。

3.5.5  凡属合格物品，应标有灭菌日期及有效期限。