微生物检测中常见的生物化学试验操作（二）

三、枸橼酸盐利用试验

原理：枸橼酸盐培养基系一综合性培养基，其中枸橼酸钠为碳的唯一来源，磷酸二氢铵是氮的唯一来源。有的细菌能利用枸橼酸钠为碳源，能在培养基上生长，并且能分解枸橼酸盐，最后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用枸橼酸盐为碳源的细菌在该培养基上不生长，培养基不变色。

方法：将被检细菌的菌悬液（挑取菌苔后，洗至生理盐水中）接种到枸橼酸盐培养基上，37℃培养24h，观察结果。

结果：培养基上有菌生长，培养基变为深蓝色为阳性，对照菌是产气肠杆菌；若培养基不变色，则继续培养7天，培养基仍不变色者为阴性，对照菌为大肠杆菌。

四、呼吸酶类试验

4.1 氧化酶试验

原理：某些细菌具有氧化酶，能将二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺试剂氧化（先使细胞色素C氧化，电子传递体）成红色醌类化合物。

方法：取白色洁净滤纸蘸取待测菌落，加盐酸二甲基对苯二胺溶液1滴；Ewing氏改进法，再加α-萘酚溶液1滴。

结果：阳性者立即出现粉红色，并逐渐加深，变为淡紫色，再到深紫色，Ewing氏改进法阳性于0.5min内呈现鲜蓝色，对照菌为绿脓杆菌（铜绿假单细胞菌）；阴性者颜色无变化，Ewing氏法阴性为2min内不变色，对照菌为大肠杆菌。

1%盐酸二甲基对苯二胺溶液要避免接触含铁物质，防止出现假阳性反应。此试剂应少量新鲜配制，于冰箱内避光保存，也可购置氧化酶试条。

该实验用于分辨革兰氏阴性杆菌中的肠杆菌科（阴性）与弧菌科（阳性）。

4.2 触酶活力试验

原理：具有触酶的细菌能催化过氧化酶，放出生态氧，继而形成氧分子，出现气泡。

方法：取3%过氧化氢0.5ml，滴加到不含血液的被检细菌琼脂培养物上，或滴加到不含血液的肉汤培养物中，观察结果。

结果：培养物出现气泡者为阳性。

说明：过氧化氢浓度过高（30%）会产生气泡出现假阳性；血液中含有触酶，容易出现假阳性。

4.3 硝酸盐还原试验

原理：某些细菌能将培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐与醋酸作用生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中的对氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸，再与α-萘胺结合，生成N-α-萘胺偶氮苯磺酸（红色）。

方法：将被检细菌接种于硝酸盐培养基中，37℃培养1~4天，每天吸取培养物2ml，加甲液（对氨基苯磺酸0.8g，5mol/L醋酸100ml）和乙液（α-萘胺0.5g，5mol/L醋酸100ml）各数滴，同时以为接种细菌的培养基作对照，观察结果。

结果：出现红色为阳性。

说明：亚硝酸盐在自然界分布很广，容易污染试剂，硝酸盐不纯或保管不妥也可能含有亚硝酸盐，因此必须做空白对照；繁殖迅速而还原硝酸盐能力强的细菌如果培养时间过久，可能将亚硝酸盐全部分解为氨和氮，出现假阴性反应，故需每天试验，空白对照。

五、毒性酶类试验

5.1 溶血试验

原理：某些细菌在代谢过程中，产生溶血素，能使人或动物的红细胞发生溶解。

方法：

1）平板法：将被检细菌接种到血液琼脂平板培养基上，37℃培养24h。

2）试管法：取被检细菌16-18h肉汤培养物若干，加等量经生理盐水洗涤三次的2%羊红细胞悬液，置于37℃水浴箱中，30min后观察结果。

结果：

1）平板法：若菌落周围出现透明的溶血环，为完全溶血（β溶血），菌落周围出现绿色溶血环，为不完全溶血（α溶血），无溶血环为不溶血（γ溶血）。

2）试管法：液体澄清透明为溶血，阳性。

5.2 链激酶试验

原理：A群链球菌在代谢过程中，产生链激酶，能激活血液中的纤维蛋白酶原为溶纤维蛋白酶，促使纤维蛋白凝块溶解。

方法：取血浆0.2ml，放入灭菌小试管中，加无菌生理盐水0.8ml，再加被检细菌18-24h肉汤培养物0.5ml，充分混匀后，再加入0.25%氯化钙水溶液0.25ml，置于37℃水浴中，观察结果。

结果：10min内血浆先凝固，而后又开始溶解，溶解时间与链激酶含量成正比。链激酶含量多时，20min内凝固的血浆完全溶解。如无变化，应在水浴中持续2h、24h，分别观察结果。血浆凝块完全溶解者为阳性，时间越短表明毒性越强。24h血凝块仍不溶解者为阴性。

5.3 血浆凝固酶试验

原理：某些细菌能产生血浆凝固酶，分两种，一种结合在细菌细胞壁上，遇到血浆直接作用于血浆的纤维蛋白，使细菌凝成颗粒状，使用玻片法；另一种分泌到细菌细胞外，称为游离血浆凝固酶，能使血浆中的纤维蛋白原变为纤维蛋白，使用试管法试验。

方法：

1）玻片法：取生理盐水2滴，分别滴于载玻片上，以接种环挑取被检细菌菌落，放在2滴生理盐水中，研磨成浓菌悬液。在1滴悬液中加1滴未稀释的血浆，另一滴加入1滴生理盐水作为对照，迅速摇动，观察结果。

2）试管法：取3支小试管，每支加1:4稀释的新鲜血浆0.5ml，其中1支加被检细菌生理盐水悬液或肉汤培养物0.5ml，另一支加阳性菌株生理盐水悬液或肉汤培养物0.5ml作阳性对照，再一支加生理盐水或肉汤培养液0.5ml作阴性对照。3支试管置于37℃水浴箱中，每隔30min观察一次结果。

结果：

1）玻片法：若在加血浆的1滴中迅速出现凝固颗粒，在加生理盐水对照的1滴中未出现凝固颗粒，为阳性；若超过2min才开始出现凝固颗粒者不作阳性（多为非致病性）。

2）试管法：6h内，若试验管和阳性对照管出现凝固，阴性对照管不出现凝固，为阳性；多数阳性细菌在0.5-1h内发生凝固。

六、嗜盐试验

原理：在高于3%的氯化钠培养基上不生长或生长不好，但能在无言培养基上生长的，称为非嗜盐菌，如肠杆菌科。能在3%-6%氯化钠培养基上生长，但在无盐培养基上不生长，称为嗜盐菌，如副溶血性弧菌。在无盐和高盐培养基上均能生长，但长得不茂盛，称为耐盐菌，如葡萄球菌、铜绿假单细胞菌。

方法：取被检细菌分别接种到1支无盐葡萄糖蛋白胨水和一支5%-6%氯化钠葡萄糖蛋白胨水中，37℃培养6-24h，观察生长情况。

结果：培养物出现浑浊生长为阳性。