性途径（结合）诱导实验

四膜虫

Tris

培养基 培养瓶

培养物准备

1. 每种交配型都在装有 100 ml 培养基的 1 L 培养瓶中接种 5 ml 最近转接过的短期贮存的四膜虫，用铝箔或棉絮塞子盖上培养瓶。

2. 30℃ 培养至对数后期，通常这一培养为静止培养。在此条件下，细胞将在 24 小时内达到所需密度。

在 10 mmol/L Tris 中使细胞饥饿起始

3. 在 pH 7.4 的 10 mmol/L Tris 中低速离心洗涤沉淀细胞，弃上清，在 Tris 中轻悬细胞。低速离心，再弃上清。

4. 在 10 mmol/L Tris 中重悬每种交配型细胞，使终浓度为 2X10⁵~2.5X10⁵ 细胞/ml。等分为 100 ml 倒入 1 L 的培养瓶中。确定保持交配型分离。

5. 用铝箔或棉絮塞子盖上培养瓶，30℃ 不振摇过夜培养。

细胞共刺激和配对形成

6. 轻微综合相同交配型的细胞并检测浓度。

7. 混合数量相等的相反交配型的细胞，在每个 1 L 培养瓶中等分装入 50~80 ml，用铝箔或棉絮塞子盖上。

8. 应使细胞在 30℃ 静止放置，直到达到所需生长期。

9. 至所需生长期，于 1500~2000 g 离心 5 分钟收获交配细胞。细胞核的形态、数量等对确定生长期是便利的特征。

10. 如配制分离的细胞核，在培养基中重悬细胞，浓度为 2X10⁶ 细胞/ml，-20℃ 冷冻贮存或直接使用。