手性色谱柱——蛋白质型

　　 蛋白质型手性色谱柱属于第5种类型。分离依赖于疏水相互作用和极性相互作用。已经有多种蛋白质用于此类手性色谱柱。目前使用较多的是α-酸性糖蛋白（α-Acid Glycoprotein，AGP），人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA），牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）和卵类粘蛋白（Ovomucoid，OV）。

　　α-酸性糖蛋白分子由181个氨基酸残基和40个唾液酸（sialic acid） 残基构成。α-酸性糖蛋白分子偏酸性，等电点为2.7。含有两个二硫键，性质很稳定。α-酸性糖蛋白分子可以共价键合到硅胶上，制成手性色谱柱，可以分离许多化合物。

　　 α-酸性糖蛋白手性色谱柱使用的流动相通常为pH 4-7的磷酸盐缓冲液和很小比例的有机相。有机相首选异丙醇，如达不到分离要求，可以尝试乙腈，乙醇，甲醇或四氢呋喃。有机相的改变导致蛋白结构发生暂时的改变。色谱柱的负载量至关重要，典型的负载量为0.02mg/ml的浓度样品，进样20μl。pH 的改变对手性选择性起关键作用，尤其是胺类化合物。pH降低导致蛋白质负电荷的降低，引起胺类化合物保留时间减小，然而这意味着可以减小有机相比例，使选择性增加，峰形改善。

　　 通过调节有机相比例仍无法达到分离效果时，有时需用电荷调节剂。但这可能引起蛋白结构的永久改变，这些电荷调节剂包括丁酸、辛酸、癸酸和二甲基辛胺。有时也用到1，2 亚乙基二醇，1，2丁醇和氯化钠。温度对分离也有影响，温度增加保留时间，减小分离因子。

　　人血清白蛋白（HSA）分子量为69,000，等电点为4.8。蛋白中认为存在两个药物结合位点：华法令-氮杂普鲁帕宗（warfarin-azapropazone） 和苯基二氮杂-吲哚（benzodiazapine-indole）结合位点。流动相中加入辛酸，采用人血清白蛋白手性色谱柱可以有效分离benzodiazapine。Warfarin 和oxazepam也用人血清白蛋白手性色谱柱得到了分离，流动相组成为：100mM磷酸缓冲液pH7：乙腈：异丙醇 = 84：10：6。

　　 牛血清白蛋白（BSA）为球型蛋白，分子量为66,000，等电点为4.7。此蛋白为一个单氨基酸链，通过17个二硫键形成9个双环。许多化合物通过牛血清白蛋白手性色谱柱得到分离。牛血清白蛋白不如α-酸性糖蛋白稳定，一些有机溶剂（如乙腈、甲醇）可使蛋白变性，因此使用起来要特别注意。

　　 卵类粘蛋白由蛋清中提取，分子量为55,000。它可分离大量的胺类和酸类化合物。

　　 蛋白手性色谱柱的载样量均较小。影响了蛋白手性色谱柱在制备色谱中的应用。

　　 蛋白手性色谱柱在所有手性色谱柱中是应用最广的色谱柱，但并不是效果最好的色谱柱。