抗原呈递细胞的选择和制备（二）

备 选 方 案 2 Con A 刺激的腹腔巨噬细胞的制备

此方案中不使用致病菌，但巨噬细胞获得率较低。将 Con A 溶 解 于 PBS (200ul/ml) ，用 0.22/xm 的滤器过滤，然后保存于 一 20°C 。 每只小鼠腹腔注射 500ul (IOOug)C o n A (附录 2E ) ， 4d 后收集腹腔巨噬细胞（见基本方案，步 骤 3〜 9) 。

备 选 方 案 3 骨髓来源的巨噬细胞的制备

附 加 材 料

10% ( V A O L929 细胞条件培养基（见辅助方案 2)，溶解于 D M E M -10 完全培养基

0.05% (V /V ) 胰蛋白酶/0.53m m o l / L E D T A

100U/ml (lOng/ml) 重组小鼠 IFN- 7 , 溶 解 于 l 〇 % L 929 条件培养基

5m l 注射器和 25 G 针头

I O O m m 无菌培养皿

IOml 无菌吸管

70p m 无菌尼龙滤网

细胞培养皿和培养瓶（可选用）

9 6 孔平底培养板或 2 4 孔培养板或 I O O m m 细胞培养皿

1 . 处 死 小 鼠（附 录 2 G )，取出股骨并去除肌肉（单 元 6.1)。

2.剪断股骨，通 过 5m l 注 射 器 和 25 G 针 头 用 4 ml 1 0 % L 929 条件培养基冲洗出骨髓，将骨髓收集至无菌 I O O m m 细胞培养皿。

3 . 用 IOml 无菌吸管反复吹打细胞团块，将细胞悬液通过 70 Mm 无菌尼龙滤网。

4.取部分细胞悬液以 1 : 5 悬 浮 于 3 % 乙酸，以溶解红细胞。加 入 等 量 的 0 . 4 % 台盼蓝染液计数活细胞。据此 用 1 0 % L 929 条件培养基调节细胞浓度至 IO6 个细胞/ m l 。

5a 扩增细胞：将细胞置于培养皿或培养瓶中培养 7d ，用 0.05% (V A O 胰蛋白酶/0.53 mmol/L E D T A 消化，收集细胞并以 5 X IO⁴〜IO⁵ 个细胞/孔 置 于 9 6 孔培养板
中培养。

5b. 不扩增培养：将细胞置于培养板：

9 6 孔培养板： 0.2m l 细胞悬液/孔

2 4 孔培养板： I m l 细胞悬液/孔

I O O m m 培养皿： 12m l 细胞悬液/个

6.对于扩增的细胞，继续培养 1〜2d 直至细胞汇合。对于未扩增培养的细胞需培养 5〜7d ，用 1 0 % L 929 条件培养基每 2 天换液。

7 . 为了增强抗原呈递效率，可在抗原呈递实验前 4 8 h 用 l O O U / m l 溶 解 于 1 0 % L 929 条件培养基的重组小鼠 IFN-y ( l O n g / m l ) 处理细胞。

辅 助 方 案 2 制 备 L9 2 9 条件培养基

材 料

贴壁培养 L 929 细 胞（A T C C 细胞株号 C C L l )

V 无 菌 P B S ，室温

0 . 0 5 % (W V ) 胰蛋白酶/O.53 mmol/L EDTA

V D M E M -IO 完全培养基

15m l 离心管

Sorvall RT- 6 0 0 0 冷冻台式离心机及 HB-IOOO 转子

培养瓶

0.45um 滤膜

1.在 25 cm2 培 养 瓶 中 培 养 L 9 2 9 细 胞 ，当细胞处于对数生长期并汇合生长时吸弃上清(10 ml)。加 入 3m l 室 温 无 菌 P B S ，摇 动 培 养 瓶 后 静 置 lmin，轻轻摇动一次后吸弃 P B S 。

2.加入 3m l0 . 0 5 % (V /V ) 胰蛋白酶/0.53 mm 〇 l/L E D T A 静 置 5 min。 盖紧瓶盖，拍打培养瓶使细胞脱落，也可在显微镜下观察细胞脱落情况

3 . 加 入 IQml D M E M -I O 完 全 培 养 基 并 将 细 胞 悬 液 转 移 至 15m l 离 心 管 ， 4°C ， 400〜500 g 离 心 lOmin，吸弃上清后，将细胞悬浮于和原培养基等量的 D M E M -10 完全培养基中。

4 . 将细胞悬液用 D M E M -I O 完全培养基作 1 : 1 0 (W V ) 稀释并转移至适当大小的培养 瓶 中（0.4m l 细胞悬液/c m 2 培养瓶）。继 续 37°C 培养直至细胞汇合，一般需要一周 。

5 . 收集细胞上清，用 0.45p m 滤膜过滤并分装成每份 1〜15m l ，置一 20°C 冻存。

备 选 方 案 4 制 备 LPS 刺 激 的 B 细胞

材 料

悬 浮 于 D M E M -I O 完全培养基中的脾脏细胞悬液（单 元 2. 1)

x/ D M E M -10 完全培养基， 37°C

LPS (如 Difco 或 Sigma)

I O O m m 细胞培养皿

50m l 无菌离心管

Sorvall R T - 6 0 0 0 冷冻台式离心机及 H B - I O O O 转子

75 cm2 细胞培养瓶

1 . 用 A C K 红 细 胞 裂 解 液（单 元 2 . 1 ) 去除脾细胞悬液中的红细胞。

2 . 将细胞悬浮于 D M E M -I O 完全培养基，计 数 活 细 胞（附 录 3 0 , 调节细胞浓度至 5 XIO⁶个细胞/ml。

3 . 将细胞转移至 I O O m m 细 胞 培 养 皿（IOml/培养皿）中，并 在 37°C 培 养 2 h ，轻轻摇动培养瓶后，将悬浮细胞转移至 50m l 离心管。

4 . 室温， 200〜300 g 离 心 lOmin，吸弃上清，将细胞再次悬浮于预热的 D M E M -I O 完全培养基，计 数 细 胞（附 录 3 0 , 调节细胞浓度至 2 X 10⁶ 个细胞/m l 。

5 . 加 入 L P S 至终浓度 10 Mg/m l 。将细胞悬液转移至 75 cm2 细胞培养瓶或 I O O m m 细胞培养皿 ， 37°C 培 养 48 h 。

6 . 轻轻摇动培养瓶使非贴壁细胞悬浮，将细胞悬液转移至 50m l 离心管， 200〜300 g 离心 lOmin，吸弃上清，将细胞再次悬浮于 D M E M -1 0 完全培养基。

7.200〜300 g 离 心 lOmin，吸弃上清，将细胞再次悬浮于预热的 D M E M -1 0 完全培养基 ，计数细胞，调节细胞浓度至 2 X 10⁶个细胞/m l 。这些细胞就可用作非贴壁的抗原 呈 递 细 胞（单 元 7. 2)。