抗氧化剂的测定

人工合成的抗氧化剂有 ：

（1） BHT    2，6-二叔丁基对甲酚

（2） BHA    叔丁基对羟基茴醚    

（3）PG      没食子酸丙酯  

近几年也合成了一些新的抗氧化剂如TBHQ,  DBHA等还有一些新的天然抗氧化剂，但投入使用的不多。

 ⑴叔丁基对羟基茴香醚结构

特点：            

1）对热稳定

2）在弱碱性中不破坏（作为焙烤食品用的抗氧化剂）

这种抗氧化剂在日本是禁止的

⑵ 2，6-二叔丁基对甲酚结构

特点：（1）抗氧化性强于BHA；（2）毒性大于BHA

这种抗氧化剂在美国是禁止使用的

⑶没食子酸丙酯结构

特点 ：（1）耐热性强；（2）溶于油脂，酒精等有机溶剂中

以上三种人工合成抗氧化剂我国都在使用，抗氧化性最强是混合使用，二种抗氧化剂混合使用效果最好，但要加增效剂，常用的增效剂有柠檬酸，抗败血酸，磷酸等可以提高抗氧化剂的作用。而增效剂主要是络合重金属离子，使氧化性获得新生。

我们从以上三种氧化剂结构中可以看出，它们都有苯酚，所以我们要找抗氧化剂必须找酚类衍生物，我们要了解抗氧化剂的机理，它们怎样阻止氧化。抗氧化剂的抗氧化机理。

油脂氧化机制  （1）链引发；（2）链传播；（3）终止

从RH代替脂肪或者脂肪酸 

第一步： RH→R^*.+H^*        

第二步：脂肪RH受热或光金属

第三步：R^*+O₂→ROO^*       RO₂^*+RH→ROOH+R^*

第四步 R^*+ R^*→R-R       R^*+ RO₂^*→RO₂R

第二步脂肪RH受热或光金属催化剂等分解成不稳定的游离基R和H, 游离基当与空气中的O₂时生成过氧化物游离基过氧化物，游离基在于脂肪RH生成氢过氧化物和游离基R，产生的游离基与游离基相互结合，使反应终止，随着反应的进行，更多脂肪分子转变成氢过氧化物，氢过氧化物进一步变化，产生更多的游离基和稳定的终产物，这些就导致了油脂完全的变质的酸败味的形成和种种的反应生成。

抗氧剂的机制（以AH代表抗氧剂）

AH+ R^*→RH+A^* 

抗氧化剂的作用机制是遇到游离基后将游离基破坏，也就是说反映关键是把R*，RO₂^*作用掉，

这样就终止了链传播，延长了酸败。　

A^*+ A^*→A－A　　　　　　　　　　

A^*+ RO₂^*→ROOA

抗氧化剂--阻止，延迟脂肪自动氧化作用的物质称为抗氧化剂。

抗氧化剂的使用剂量为　　０.０２％  即万分之二

增效机剂为抗氧化所加的１/４---１/２即０.０１％

抗氧化剂是油溶性的，所以能引起油脂酸败，植物油比猪油保存的时间长因为植物油或多或少的含有一些抗氧化物质比如生育酚等，而猪油不含有抗氧化剂所以易腐败。

一. BHA测定（比色法）

1.原理  用石油醚将样品中的BHA提取出来，根据BHA在石油醚和含水乙醇项中分配系数不同，使其溶解72%的乙醇中，BHA与2，6-二氯醌氯亚胺的硼砂溶液生成一系列兰色反应，可比色测定620nm.

2.操作方法

 (1)绘标准曲线   编号   1     2     3     4       5       6

 BHA标液10μg/ml    0.    0.1   0.3   0.5    0.7    0.9

72%乙醇      ————→分别稀释12ml←———————

0.01%2，6---二氯醌氯亚胺  2     2     2     2     2     2

硼砂溶液2%                         2     2     2     2     2     2

静止15分钟

比色620nm       绘制标准曲线

(2)样品分析

称鱼肉2g→于50ml量筒→加无水乙醇2 ml→石油醚（30-60℃ ） 48ml→摇匀→静止24小时→吸上溶液25ml→于125ml分液漏斗中→用72%乙醇分四次提取→合并于50ml容量瓶→加72%乙醇于刻度，若浑浊过滤→取2ml于比色管中→加72%乙醇12ml→加2，6---二氯醌氯亚胺2ml→硼砂溶液2ml→静止15分钟→620nm比色

(3)计算 BHA(μg/kg)=V*V₁*C/W*V₂*V₃

V--------样品定容总体积(ml)

V_{1------------}将提取液定容(ml)

C---------相当于标液浓度

W--------样品的重量（g）

V₂--------取样品总体积(ml)

V_3-----------测定时所用提取液的总体积

BHA(mg/kg)=C/W *100                            

C-------相当于BHA的标准量(mg)

W------相当于样品溶液的重量(g)

注意事项：

染料2，6---二氯醌氯亚胺溶液见光后易变质，储于棕色瓶中超过6小时经重新配制在冰箱中可保存3天，一般为用时配制。

例：腌鱼肉2克定容50 ml取出25ml提取BHA定容50ml,测定时取2ml, 取溶液（相当于5微克）代入上式计算

BHA(mg/kg)=V/W * V_1-/ V₂ C/ V₃=50ml/2g *50ml/25ml *5μg/2ml=125(mg/kg)

二 PG（没食子酸丙酯）

没食子酸丙酯（PG）也是常用的一种抗氧化剂，由于其合成工艺简单，原料低廉，广泛用于低档产品中它是由没食子酸和正丙醇酯化而成的白色或微褐色结晶性粉末，本身微苦，熔点145-148℃，有吸湿性，耐热性强，溶于油脂，酒精等有机溶剂中。动物性油脂中抗氧化能力较强，遇铁离子容易出现呈色反应。

1.     比色法原理：

PG与2，2^，--联吡啶---氯化铁溶液生成橘红色的发色团，所生成的颜色深浅与PG的含量成正比关系，在530 nm下比色。

2.     操作步骤

a.制标准曲线

取10ml比色管    1     2        3     4      5     6    

PG(10μg/ml)     0    0.5    1.0    1.5   2.0   2.5

无水乙醇(ml)      2.5   2.0    1.5    1.0   0.5   0

加水                           ———→5.5ml——————

避光出加显色剂     ————1ml ←————

暗处放1小时 ，530nm处比色

b.样品的处理：称样5g→于烧瓶中→加石油醚50ml→振动30分钟→取上清夜25 ml→于分液漏斗→用40 ml水提取三次→提取液合并于50 ml容量瓶→加水至刻度供测定

c.测定： 吸2 ml与比色管→加无水乙醇2.5ml→加水3.5 ml→摇匀→暗处加2，2^，--联吡啶---氯化铁溶液1ml→三氯化铁1ml→暗处放1小时→530nm比色，同时做空白

d.计算：PG(mg/kg)=V₁/W *V₃/V₂  *C/V₄ *1000/1000  

C---相当于标准PG的浓度（μg/ml）

V₁---样品稀释总体积（ml）

V₂---取总体积进行提取（ml）

V₃---提取后定容(ml)

V₄---比色时提取液体积（ml）

三 BHT的测定

为了提高油脂的稳定性，防止酸败，延长保质期,近几年来国内已开始在食用油中添加抗氧化剂，由于抗氧化剂BH、PG对热稳定性较差，而BHT的热稳定性较好，能适应精练油的全过程，所以在食用油中添加抗氧化剂BHT。

1.比色法原理

油脂中的抗氧化剂BHT经水蒸气蒸馏法将BHT从油脂中分离出来，其蒸馏液将BHT从油脂中分离出来，其馏出物经冷凝后溶于甲醇中，遇邻联二茴香胺，亚硝酸钠试剂，生成橙红色物质，用氯仿萃取后的深红色溶液在520nm处比色测E。

3.     标准曲线的绘制

取6个用黑布扎的60ml分液漏斗,分别吸BHT标准溶液5μg/ml 于60ml分液漏斗中→加50%甲醇溶液至25ml→ 加邻联二茴香胺溶液5ml→摇匀→加0。3%亚硝酸钠2ml→摇1分钟→放置10分钟→加氯仿10ml→摇1分钟→分层后→将下层氯仿放入黑纸包扎的10ml比色管→520nm测E→绘制标准曲线                              

3.样品处理

将油脂样5g→于500ml蒸馏瓶→加无水CaCL₂ 16克→水10ml→当温度达到165℃→连接好水蒸气装置→用50ml甲醇的容量瓶接收（最好是200ml）→收集馏液为100ml(共计150 ml)→用热甲醇（40-50℃）分次洗涤冷凝管→合并于容量瓶→用甲醇定容200ml

4.  测定

吸馏液25ml→于黑布包扎的60ml分液漏斗→加邻联二茴香胺溶液5ml→摇匀→加0.3%亚硝酸钠

2ml→摇匀1分钟→放10分钟→加10ml氯仿→振摇1分钟→分层后→将氯仿液放入黑纸包扎的10ml

比色管→520nm下测E

5.  计算

BHT(mg/kg)=V/W*C/V₁  

W----样品重量(g) 

V----样品定容体积(ml)  

V₁------测定时所用的提取液体积（ml）

C-------相当于标准浓度(μg)

6.     注意事项：

(1)  控制蒸气后不要太高，以免油滴带出，影响测定结果

（2）蒸馏结束后，用热的甲醇淋洗弯管以及冷凝管必须少量多次，以免冲洗不干净，影响结果偏低。

（3）加入显色剂后的反应时间以5—7分钟显色到达最高峰10分钟之内保持恒定，然后逐渐褪色，所以必须静置10分钟，然后立即加氯仿萃取。

（4）氯仿萃取后，放于暗处1小时，如果暴露于光线中会很快褪色。

（5）所生成的有色物，对光具有敏感性，在暗处内操作最好

四 BHA和BHT混合使用时分离与测定方法，分别显色比色法

1.原理    

用石油醚提取食品中的BHA和BHT。通过硅胶柱使BHA和BHT分离，BHA与2,6---二氯醌氯亚胺-

硼砂溶液生成兰色。BHT与2，2^，---联吡啶