抗肿瘤方面细胞实验心得

养细胞1年多了，走了很多弯路，我从我曾经的疑惑或者犯的错误出发讲起，能够让部分人少走点弯路，那我就知足了。

我之后的实验方向与细胞实验基本无关了，所以此时写点心得也是对自己的总结。

因为多是个人总结的经验，难免有错误，请多见谅；

个人的经验也离不开曾经别人的指引，需要感谢帮助过我的同学及坛友。
我最初养细胞时，实验室并没有储备课题所涉及的细胞，所以最初筹集细胞占用了较多时间，我首先想讲一下细胞的运送；

1、寄运细胞或者接收细胞，都要做好充足的准备;

        如果是让其它实验室寄运细胞，或者寄给别人细胞，细胞应该如何处理是主要考虑的问题。假设细胞在途中要经过48小时，那么可以待细胞长到50%的密度时处理细胞，即将细胞培养瓶内加满培养液，拧紧瓶盖，用封口膜封紧瓶口；然后将培养瓶放进泡沫盒，用纸或泡沫将盒内空间填满，使培养瓶不能随意移动。同时将泡沫盒钻上几个孔，使空气可以流通。

        因此要确定准备好以下物品：透气的细胞培养瓶；封口膜；足量的培养液；放细胞培养瓶的泡沫盒及填充物；

        除了细胞的处理，还要注意以下几点：1）提前跟快递公司人员联系，要上门取货（大多快递公司都可以，顺丰确实算是好些；近来觉得韵达速度也很快）2）时间安排（细胞处理尽量安排在下午，因为快递公司一般来说都是晚上统一发货，要是早晨处理细胞交给快递公司，细胞还没上路呢，就已经在培养箱外待了一天）；

        接收细胞就容易多了，提前准备好细胞培养用耗材及培养用液就可以了，紫外灯先打开，收到细胞将培养瓶中大部分培养液吸掉，留下4-5ML培养液（针对25cm2的培养瓶）；培养一天后，观察细胞状态，确实是传代还是换液。

        总而言之，运送细胞讲究两点：1离开了培养箱要防止被污染2尽量缩短细胞不在培养箱的时间，不然时间过久细胞长满脱落就没得救了。

2 要讲的是MTT试验，这个纯粹讲个人经验，因为我本身的考虑可能就是错的，所以非常欢迎提出疑问以及批评指正。

        1）细胞的铺板：以96孔板为例，做细胞实验的同学看文献可能注意到，有较多的文献中提到细胞接种数量是5000个/孔；最初我也是按照这个数量来铺板的，实际上这个接种数量偏高；假设给药时间是48小时，发现空白对照孔中会有细胞无法贴壁，因为太满了，被挤出来了。如此，则会因为接种密度原因，而不能准确反映细胞的正常生长情况及给药组作用情况。即使是给药时间为24小时，仍然会出现类似情况。

        因此，我后期实验中接种细胞数量为3000-4000，如果是药物作用48小时，最好是3000cells/每孔，空白对照孔细胞在加MTT前也就刚好长满，后来才发现别人也很多按照这个数量接种的，只是提醒需要注意，不要盲目的按照5000这个密度，还有的是10000，基本上不靠谱。

        很明显，接种细胞数量太少也不好，太少的话SD值会很大。

        还有的人根本就不计数，经验主义，一个25cm2培养瓶细胞长满铺一个板；经验当然是有用的，但在这里就明显不合理了，刚才提到MTT实验对细胞的数量要求相对较精确；另外，如果你是铺几个板，都这样做，本来每个培养瓶细胞数差异就不小，因为你传代时做不到等量，就这样直接铺到板上，不同板之间又有各组药物的对照实验，那么得出的OD值还可以比较吗？所以计数是必要的。

        2）给药：对于水溶性药物就不讲了，只讲难溶于水，而且虽然溶于DMSO，但向DMSO加水后也会析出的药物；有人是这样做的，在EP管中用DMSO溶解药物作为母液，然后用细胞培养液将母液梯度稀释成各个浓度，药物有析出，成结晶了，可能都沉了，严重不均一了，这浓度就没法衡量了；

这样做的人，也想过不合理之处，但又没有查到好的办法，所以将就着做了，其实差多了，有效的药物也做成无效的了。

还有一个错误容易犯，DMSO母液用培养液稀释10倍后是不可以作用于细胞的，因为这样DMSO占的比例是10%，本身毒性就很大；我曾经单独测过DMSO对细胞的毒性，1%确实基本无影响，但5%以上则是影响特别大。现在做个假设，用DMSO稀释母液，而非用培养液，在EP管中用DMSO梯度稀释药物成各个梯度浓度，然后直接加到含培养液的96孔中，假设96孔中培养液为197微升，那么加药的体积只能是3微升或者小于3微升。我觉得可以这么做，操作会更麻烦，难度上稍大了点，但不是不能做。对于没有一点亲水基团的药物，我就是这样做的。

有些药物常温下难溶于水，可能加热溶解性会很好，由于专业涉及面不同，很多人会忽略这方面。开始做阿霉素时就没注意到，后来听企业人员说加热到55℃可以很好的溶解，按此法溶解效果很好。

另外我认为，对溶剂进行优化是进行难溶性药物实验要学习的一个方面，找到加水后药物不析出的药物溶剂，可以是有机溶剂，也可以是制剂中用到的辅料；对于已经上市的用于注射剂的阳性对照药，肯定有办法，像顶顶大名的紫杉醇，其实就是用吐温80和乙醇。

3 细胞的消化前几天到学院路玩，两个人说到养细胞，一个说是细胞养的越久越容易消化，另一个说是细胞养的越久越难消化；谁说的对，我不确定；但多数人消化没有一惯的按照同样的方法进行消化细胞，主要说两个因素：胰酶的活性（胰酶的品牌及已经使用的时间，反复冻融的次数等），消化的温度（包括加入胰酶液的温度和培养器皿外环境的温度）。

为了保持一惯性，建议如下：1是胰酶分装2胰酶的温度和环境温度一惯性

不要小瞧了这般，可能遇到难消化的细胞时，就表现不出自己是个养细胞的人了：都不知道把胰酶融化后多放在37℃几分钟，也不知道将将细胞转移到培养箱消化，也不考虑自己的胰酶已经反复冻融了多次。当然也可能有些人养了一年或两年细胞，从没碰到难消化的细胞。
如果这样也不行，利多卡因（5ml装利多卡因+7.3mlPBS）方法也是可以用的，当时养RAW264.7中途碰到消化不掉的情况，利多卡因这个方法是院里老师传授的。其实网上搜也能搜到，但比较麻烦，因为网上可能众说纷纭，你不可能试了一个又一个。明显经验是很重要的，如果没人带着做实验，自己很容易乱放炮，不得要领，这都有体会。

4 悬浮细胞的培养根据常规培养悬浮细胞的教程来看，培养过程要比贴壁细胞容易；我最初拿到K562细胞时，我问及注意事项，其中一个是如何判断细胞长满？对方说培养液变黄时就可以换液或者传代了。我觉得不怎么合理，但又没有想到好的办法。开始几天就这样养的，同时查找资料寻找更合适的方法。当时没事喜欢发贴子。通过小木虫的求助，得到了较满意的答复，并且按照这个建议一直做下去，发现是挺可行的。
接种密度控制在1-3×10^5cells/ml就可以，有时0.2-0.5×105cells/ml的低密度接种也是可以的，不必把密度接种很高，这样影响细胞的生长，也增加培养基的消耗和人工。当细胞的密度增加到6-10×10^5cells/ml时（通常用72hrs）就对细胞进行传代。维持低细胞密度是非常好的办法。经常计数，是掌握细胞生长规律最好的办法。
先写这些，希望大家能够多多批评指正，共同进步。