拟南芥种子萌发和非生物胁迫的相关研究

　　2021年6月15日，Cell Reports在线发表了西班牙萨拉曼卡大学生物系Oscar Lorenzo教授团队完成的题为“Redox feedback regulation of ANAC089 signaling alters seed germination and stress response”的研究文章。该研究发现NAC转录因子家族成员ANAC089是氧化还原稳态和NO水平的主要调节因子，并在拟南芥种子萌发和非生物胁迫期间抑制ABA合成和信号转导。

　　研究背景

　　植物激素脱落酸（ABA）和气体信号分子一氧化氮（NO）参与调控种子萌发和萌发后幼苗的生长。ABA 通过转录因子（TF）的复杂信号级联反应来精细调控ABA 响应并诱导基因表达的变化。NAC（NAM-ATAF1,2-CUC2）家族蛋白是ABA诱导型TF成员，拟南芥NACs，如ATAF1/2、ANAC019/055、NAC2和NTL8等，在不同发育期间参与ABA依赖的非生物胁迫响应。已知在种子萌发过程中，NO通过N-degron途径和S-亚硝化修饰机制干扰ABA信号转导以促进种子萌发。然而，与ABA依赖性靶标相关的NO稳态调节信号成分目前还是未知的。

　　主要结果

　　1.GAP1编码在种子中高水平表达的ANAC089转录因子

　　为进一步解析ABA和NO对种子萌发的调控，通过遗传筛选以鉴别gap（germination in ABA and cPTIO；cPTIO为NO专一清除剂）突变体，结果除abi5外，还分离出gap1-1和gap1-2两个突变体。经鉴定分析，它们的致变基因为At5g22290，编码C末端包含跨膜结构域（TM）的NAC转录因子ANAC089。ANAC089在种子成熟期间表达，在干种子中的表达水平最高。而且ABA处理能诱导吸胀种子中ANAC089的表达。

　　2.gap1-1和gap1-2是功能获得性突变体

　　萌发实验结果显示，gap1-1和gap1-2对cPTIO添加所导致的内源性NO消耗表现不敏感，但野生型和gap1-3敲除突变体的种子萌发则在cPTIO处理后受抑制。同样，gap1-1和gap1-2在种子萌发和幼苗建成期间显示ABA不敏感表型。胁迫处理发现，gap1-1和gap1-2对干旱、盐和低温的耐受性增强，以上表明它们为功能获得性突变体，同时也说明ANAC089参与调控非生物胁迫响应（图1）。此外，全基因组转录图谱和DNA结合特异性分析表明，ANAC089能够识别并结合氧化还原稳态和ABA响应相关基因启动子上的特定顺式调控元件，以调节拟南芥种子的萌发。

　　图1. 种子萌发和胁迫期间ANAC089的功能鉴定

　　3.gap1突变体改变种子中NO、ABA、硫醇和二硫化物的水平

　　已有研究通过NO特异性染料检测发现，在种子吸胀后的胚乳中，gap1-1和gap1-2的NO丰度较高，本研究结果表明种子胚中也存在高水平NO。与野生型相比，gap1-1和gap1-2在种子吸胀过程中NO的释放量均显著增加。另外，两gap1功能获得性突变体显示ABA和cPTIO处理不敏感表型，这是由于它们在种子吸胀后较低的ABA和较高的NO内源性水平。此外，gap1-1和gap1-2成熟种子中低分子量硫醇和二硫化物的含量明显高于对照。gap1-1中硫醇：二硫化物比率的变化可导致GSNO浓度的改变，GSNO是内源性NO的主要储存形式，从而增加种子萌发期间的NO水平。

　　4.氧化还原修饰改变ANAC089的亚细胞定位

　　之前研究将定位于细胞质或内质网的ANAC089完整编码序列用于体内研究，同时也对缺乏TM的ANAC089截短形式进行组成性核定位观察。本研究将ANAC089 N端连接GFP标签，并构建了35S:GFP-ANAC089过表达株系以检测在不同NO/氧化还原相关和ABA处理下的ANAC089定位。GFP-ANAC089在对照条件下显示核外定位已被证实，且在低温、ABA、NO供体GSNO和二硫化谷胱甘肽（GSSG）处理后也检测到这种亚细胞定位模式。相反，NO清除剂cPTIO和还原剂处理则使锚定在内质网膜上的GFP-ANAC089以C端TM截短形式释放进入核定位（图2）。这些发现意味着通过降低内源性NO水平或增加还原剂所引发的细胞氧化还原状态的改变，能够促使ANAC089易位到细胞核并促进ANAC089蛋白的积累，以行使转录调控功能。

　　图2. NO和氧化还原相关处理影响ANAC089的亚细胞定位和蛋白积累

　　一图解文

　　GAP1所编码的ANAC089转录因子在种子中高水平表达，作为ABA合成和响应抑制因子，对低温、盐和干旱等非生物胁迫具有正调控作用。胞内氧化还原状态的变化诱使胞质ANAC089易位至细胞核，在核内，ANAC089与氧化还原稳态和ABA响应相关基因的启动子特异性结合，从而反馈调节NO水平和细胞氧化还原状态，并抑制ABA合成和信号转导。

　　图3.ANAC089在种子萌发和非生物胁迫响应中的调控模型