比率检测氯化钡诱导的大鼠嗜碱性白血病细胞上内向整流钾通道（Kir）的变化
简介
FLIPRTETRA和电压敏感探针：比率检测氯化钡诱导的大鼠嗜碱性白血病细胞上内向整流钾通道（Kir）的变化。离子通道和转运体是位于细胞膜上调控离子穿过生物膜的蛋白质。对这些蛋白质的研究已经引起了心律失常、高血压和神经紊乱等疾病的药物治疗开发。同时，这些蛋白质也是药物不良反应潜在的作用位点。高通量筛选方法在使用最小量化合物产生有用数据方面具有高效率和成本效益好等特点。FLIPRTETRA® 系统配置了390–420nm波长激发光LED以及440–480nm和565–625nm波长的滤光片，使用电压敏感探针(Voltage Sensor Probe, VSP)染料用于基于FRET原理的高通量筛选（HTS）实验，提供了一种新型的细胞基础的膜电位变化检测方法。在本实验中，包含了一种内向整流钾通道（Kir）的大鼠嗜碱性白血病细胞——RBL-2H3被诱导引起了细胞膜电位变化。氯化钾被用来引起细胞膜去极化，而氯化钡被用于阻断这个去极化反应。比率化分析对FRET数据进行了背景校正和直接对比。本篇应用文章展示了FLIPRTETRA系统结合VSP染料所带来的灵敏和高效的离子通道与转运体引起的细胞膜电位变化的检测实验。
基于FRET的电压敏感探针作用机理
电压敏感探针是一种基于荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer ，FRET)原理的用于高通量离子通道药物研发的实验技术。FRET供体--香豆素-磷脂(coumarin-phospholipid，CC2-DMPE)只结合在细胞膜外侧。FRET受体是可移动的、带负电荷的疏水性类菁染料化合物染料(oxonol)[DiSBAC2(3)或DiSBAC4(3)]，根据膜电位变化结合在细胞膜的一侧。静息细胞膜电位是负的。因而，两个探针都结合在细胞膜的外侧，实现有效的FRET效应。390–420nm波长LED 激发CC2-DMPE供体探针，从oxonol受体探针处产生580nm波长强的红色荧光信号。当细胞膜电位变正后，例如KCl引起的细胞去极化，oxonol受体探针快速的改变位置至膜的另一侧。因此，每个oxonol受体探针对细胞电位变化“感受“并反应。这种转移位置打破了FRET效应，CC2-DMPE供体探针激发后在460nm波长产生了强的蓝色荧光信号。
