液相色谱（HPLC）入门（一）

什么是液相色谱?

历史概述和定义

液相色谱的定义是二十世纪早期由俄罗斯植物学家 Mikhail S. 茨维特提出的。他最先尝试在装满颗粒的柱子上使用溶剂来分离从植物中提取的化合物[树叶色素]。茨维特用颗粒填满开口的玻璃柱。他发现两种特殊的材料，粉笔末(碳酸钙)和氧化铝很有用。他将样品[混匀植物叶的溶剂提取物]倒入柱中，并让样品流过颗、粒床。随后加入纯溶剂。随着样品由于重力自上而下流过柱子，可看到不同颜色的谱带被分开，因为有些组分比另外一些移动得快。他将这些分开的不同颜色的谱带与样品中原有的不同化合物相关联。他还根据每一种化合物对填料的化学亲和性强弱，提出了分析这些化合物的分离规律。与颗粒填料有较强亲和性的化合物移动慢，与溶剂有较强亲和性的化合物移动快。这个过程可这样描述：样品中的化合物在流动的溶剂(流动相)与固体颗粒(固定相)间的分布不一样。这样使每一种化合物以不同的速度移动，从而产生了化合物之间的分离。

茨维特使用色谱法 chromatography [来自希腊字， chroma 意思是颜色， graphy 意思是记录 - 直译为颜色记录] 来描述他的彩色试验。[令人好奇的是，俄罗斯名字茨维特意思是颜色。]今天，液相色谱法，以各种形式，已成为分析化学中最有力的工具之一。

技术1. 样品被点在固定在玻璃板上的薄层色谱颗粒[固定相]上，并流过薄层[图 B]。玻璃板的底端放置在溶剂中。由毛细作用产生的流动使溶剂[流动相]扩散到干燥的颗粒层并沿玻璃板向上移动。这种技术被称为薄层色谱法或 TLC。

技术 2. 在图 C 中, 样品被点在纸上[固定相]。溶剂[流动相] 加在样品点的中心以产生向周围的辐射流动。这是纸层析的一种方式。[传统的纸层析色谱和直线流动的薄层色谱是类似的操作方式。]上图中，相同的黑色 FD 和 C 染料被点在纸上。

图 C: 纸层析法

当和薄层色谱板比较的时候，请注意这种特殊纸张分离能力的区别。绿色圆环表示这张纸无法分离黄色和蓝色染料，但它可以将红色染料分离开来。下图中，由同样的黄色和蓝色染料组成的一个绿色样品点在纸上。如你能预料的，这张纸无法分离这两个染料。在图中，由红色和蓝色组成的紫色样品被点在纸上，它们被分离得很好。

技术3.在这个最有效的方法中，样品流进一个柱子或填有适当颗粒[固定相]的柱管装置。这些颗粒称为色谱填料。溶剂[流动相]流过这个装置。在固相萃取中[SPE]，样品被装入柱管里，溶剂携带样品流出这个装置。正如在茨维特的试验中，样品中化合物由于在管路中的流动速度不同而得以分开。黑色样品被放入柱管里。每一步使用不同溶剂得到分离。

图 D-1: 柱色谱法 - 固相萃取 [SPE]

当使用管路的形式时，有几种方法可以产生流动。重力或真空可用在不能承受压力的柱子上。特别是，本试验中使用的颗粒粒径较大[大于五十微米]，所以产生的流动阻力很小。开口玻璃柱[茨维特的实验]是个典型的例子。除此之外，小型塑料柱，典型的例子是针筒的形状，可装入填充物颗粒用于分离样品。这种方法称为固相萃取[SPE]。在此，管状的色谱装置称为固相萃取小柱，通常在真空助力下流动，被用来净化复杂样品以便进一步分析。要想提高分离能力，必须使用粒径小的填料颗粒[小于十微米]。然而，小颗粒对流动产生更大的阻力，所以要获得预期的溶剂流速，需要更高压力。必须设计能承受更高压力的泵和柱子。利用中高压力使溶剂流过色谱柱的方法，就称为 HPLC。

图 D-2: HPLC柱

什么是高效液相色谱法[HPLC]?

缩写 HPLC, 引自 Csaba Horváth 教授之后在 1970 年匹茨堡大会上的文章，原指在填料柱中产生所需的流速需要高压 (high-pressure) 这个事实。早期的泵只能承受 500 psi [35bar]。这就被称为高压液相色谱法[HPLC]七十年代早期取得极大进步。新型的高压液相色谱仪器可以承受 6,000 psi [400 bar]的压力，还能配上改进的进样器，检测器和色谱柱。高压液相色谱法确实开始成为二十世纪七十年代中晚期的普遍分析方法。随着这一期间不断的性能改进[更小颗粒，更高压力], 字母缩写保持一样，但全称变为高效 (high-performance) 液相色谱[HPLC]。高效液相色谱[HPLC]是目前分析化学最强大的工具之一。它能够分离、定性和定量任何可以溶解在液体中的化合物。今天，痕量化合物甚至低至千万分之一[ppt]也可。

高效液相色谱如何工作?

一个储液瓶装有溶剂[称为流动相，因为溶剂是流动的]。一个高压泵[溶剂传输系统或称溶剂管理器]用来产生和计量流动相的流速，一般是毫升/分钟。一个进样器[样品管理器或自动进样器]可以将样品导入[注射]连续的流动相 ，并由流动相携带样品进入高效液相色谱柱。色谱柱装有能获得分离效果的填料。这种填料称为固定相因为它被柱硬件包围住。检测器用来查看化合物流出色谱柱时被分开的谱带[大多数化合物没有颜色，所以人眼观察不到]。流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。这种方法称为制备液相[在高效液相色谱量级中讨论]。注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。

图 E 描述了高效液相色谱系统的各组成部分。

检测器连接计算机数据站，高效液相色谱系统单元先记录电信号，再将电信号转换为色谱图，在显示屏上展现出来。定性和定量样品内溶物浓度(如图F)。由于样品中化合物性质差异很大，几种类型的检测器被开发出来。例如，如果一个化合物能吸收紫外光，可使用紫外吸收检测器。如果这个化合物发荧光，可使用荧光检测器。如果该化合物没有上述性质之一，可使用更广泛的检测器，如蒸发光散射检测器[ELSD]。最强大的方式是顺序使用多个检测器。例如，紫外和/或蒸发光检测器可和质谱仪[MS]联用来分析色谱分离的组分。这样，从一次进样，可得到分析物的更多综合的信息。将质谱与高效液相色谱系统耦合称之为液质用.

高效液相色谱操作

一个简单的方法来理解如何获得样品中化合物的分离，如图 G 中简图所示。流动相从左侧进入色谱柱，流过颗粒层，再从右侧流出。绿色箭头代表流动方向。首先，上图表示在零时的色谱柱[进样时]，当样品进入色谱柱并开始形成一个谱带。这里显示的样品，是黄色、红色和蓝色染料的混合物，在进样口形成一条单一的黑色样品带。

[现实中，这个样品可以是任何能够溶解在溶剂中的物质；一般来说化合物是没有颜色的，色谱柱壁也不透明，所以我们需要一个检测器来查看洗脱出来的分离组分。]

几分钟后 [下图], 流动相连续并稳定通过填料层，我们可以看到不同的染料已经以不同的速度在分离开的谱带中移动。这是因为在流动相和固定相之间存在对每种染料或分析物的吸附竞争。留意黄色染料谱带移动最快，即将流出色谱柱。黄色染料比其他染料更喜欢[被吸附于]流动相。因此，它的流动速度较快，更为接近流动相的速度。蓝色染料谱带喜欢填料而不是流动相。它与填料颗粒有较强的吸附力使得它移动明显更慢。换句话说，它是这个混合样品中最强被保留的化合物。红色染料谱带对流动相吸引力一般，因此在色谱柱中的移动速度中等。由于每一种染料谱带移动速度不同，我们能够进行色谱分离。

Figure G: Understanding How a Chromatographic Column Works - Bands

什么是检测器?

当分开的染料谱带离开色谱柱后，它们马上进入检测器。检测器带有可以在流动相背景下看[检测]到每个分开的化合物谱带的流通池[如图 H]。 [实际上，在通常的高效液相色谱分析浓度下许多化合物的溶液都是无色的。]一个合适的检测器有能力辨别化合物的存在，并发送相应的信号到计算机数据站。正如前面谈到的，根据所需分离和分析的化合物的特性和浓度，可以在众多的检测器中选择其一。