液质联用中的数据采集和分析

　　质谱仪器的主要控制系统包括电源控制、同步与时序控制、数据采集三大部分，三大部分的整合则是通过控制软件来达成，本文不再详述。下面主要介绍一些常见术语和一些特殊的方法。

　　1、质谱图

　　质谱图的X轴代表质荷比，Y轴代表离子峰的相对强度或以离子数目呈现。原始质谱图称作轮廓谱图（Profile Spectrum），用各离子峰的重心点（Centroid）来表示的谱图称作棒状图。

　　2、离子流色谱图

　　各组分从色谱流出后进入质谱进行分析。以保留时间为横坐标，然后以离子强度为纵坐标，绘制谱图。此处的离子强度指的是所有离子或特定范围内离子强度的和，即在质谱内进行扫描时，每次扫描都会产生一张质谱图，将每一张质谱图中所有离子强度相加，得到一个总的离子流强度图，称为总离子流色谱图（Total Ion Chromatogram，TIC），如果是提取某种特定化合物的离子峰图，称为提取流色谱图（Extracted Ion Chromatogram，XIC）；相应时间下出现的丰度最强的离子峰图称为基峰色谱图（Based peak Chromatogram，BPC）。

总离子流色谱图TIC和提取流色谱图XIC

　　3、整数质量、精确质量、单一同位素质量

　　根据IUPAC，碳原子质量被定为12.00000 amu，因此其它原子和分子的质量都是非整数值。低分辨质谱的质量分辨率及精密度不够，通常只能观测到整数质量（Nominal Mass），提高分辨率后，可以观测到非整数质量的信息。

　　一般而言，质量分辨率>10000的质谱仪，可以提供小数点后四位的质量，这种质量信息称作精确质量（Accurate Mass），可据此提供元素组成的信息，对于化合物的鉴定有很大帮助。

　　4、质量分辨率和质量准确度

　　质量分辨率（Resolution，R）是指分开两个峰的能力，刚刚分开时两峰之间的质量距离是ΔM，R＝M/ΔM，M可理解为两个刚刚分开的峰的平均质量。 最严格的分辨率定义是磁质谱的，要求相邻两峰10％峰谷分开才算真正分开。而液质联用中的各类质谱分辨率的定义是要求50％峰谷刚刚分开就算分开。因为实际工作中很难找到恰好在50％峰谷分开的峰，所以又简化为用单峰法表示，即测定一个峰的半峰高处的全峰宽Full width half Maximum（简写为FWHM），FWHM应近似等于ΔM。单位质量分辨率一般认为FWHM＝为0.5或0.7。

　　质量准确度的定义为实验测量质量（Mexperimental）与理论计算质量（Mtheoretical）的质量误差（Mass Error），它表达为Mass Error/Mtheoretical，此值通常乘以10⁶，以ppm表示。

　　5、灵敏度、检测限与校准曲线

　　灵敏度常用信噪比（S/N）表示，计算方法有两种：均方根（RMS），峰峰比（S/N）。 均方根（RMS）计算方法信噪比最高，峰峰比方法信噪比最低。比如，液质联用常用进样1pg利血平的信噪比作为仪器验收的指标。为了进一步体现高灵敏度，有时验收时用fg级痕量物质测定检测限（S/N>3）。

　　在定量分析时，分析物产生的信号需在仪器的动态范围（Dynamic Range）内，动态范围定义为信号与含量成正比的范围，这样才能利用校准曲线准确地确定分析物的含量。

　　最低可产生线性信号的分析物浓度或质量称为定量限（Limit of Quantitation，LOQ），一般用S/N>10来定义。最高可产生线性信号的分析物含量称为线性限（Limit of Linearity，LOL），当分析物产生的信号超过LOL时，由于检测器过饱和，观察到的信号将会比预期是线性关系所产生的信号低。

　　6、多电荷谱图分析

　　大分子（如蛋白质、多肽）在酸性溶液中分析，其电喷雾电离会形成带有多个正电荷的谱图，可以应用价态去卷积（Charge Deconvolution）来获得其分子量。一般会使用相应的软件，其基本原理为先计算价态，再计算分子量。

ESI电离后胰蛋白酶的多电荷谱图

　　除去卷积方法外，高分辨质谱图对大分子质量的判定，也可由其同位素峰间的差距计算出该分子峰的离子电荷数，进而获得其分子质量。

　　7、使用质谱进行定量的分析方法

　　用液质联用选择特征离子进行定量分析是必要的，在高分辨质谱中，可以使用更窄的质荷比范围收集分析物信号定量分析，来降低样品中相似质荷比的基质信号干扰。在低分辨（单位质量分辨）质谱中，必须使用分析物质荷比±0.5 Th的范围内所得到的信号进行定量（质荷比选择宽度1 Th），此外用串联质谱的MRM或PRM也会大幅降低干扰提升专一性；用对分析物更有利的电离方法，选用合适的前处理方法，也能提升定量的专一性。

　　外标法

　　指使用不同浓度的分析物标准品，得到不同分析物信号进行校准曲线绘制，再使用校准曲线所得到的分析物浓度与信号的回归线计算样品中分析物的浓度。由于基质的影响，必须将不同浓度的标准品配制在接近于样品基质的溶液中，来建立校准曲线。要注意的是，基质溶液必须不能含有分析物，因此并不是每种分析法都适合进行外标定量法。此外，制作校准曲线需在动态范围内至少有4~5个不同浓度的数据点，建好后需以不同于校准曲线制备标准品来源的标准品来确认校准曲线的适用性，其浓度最好是校准曲线的中间点，而且必须定期以标准品核查。

　　标准加入法

　　当无法得到代表样品基质的溶液时，可利用标准加入法（Standard Addition Method）进行定量分析。标准加入法为直接加入不同量的分析物标准品到样品中并建立标准曲线。标准加入法所建立的标准曲线由于直接是在样品中建立，因此校准曲线的斜率与真实样品最相近，标准加入法所建立的校准曲线其外延至样品含量的轴为负值的浓度即为样品内分析物的真实浓度。此方法必须将样品分成多个等份，并加入不同量的标准品进行校准曲线绘制，由于每个样品均制作标准曲线，因此样品需要较多且分析时间也相对较长。

利用标准加入法定量

　　同位素内标法

　　质谱使用同位素内标法定量的最大好处是可以使用与待分析物结构完全相同的稳定同位素标准品进行分析，可以消除分析过程的误差，并可在质谱分析时因其与待分析物质量的差异，将标准品与待分析物信号完全分离，不会互相干扰。

　　在样品前处理以及分析过程中就先加入同位素内标物，可消除样品在处理以及分析时回收率、基质效应以及质谱分析时因离子化或是电子元件不稳定造成的定量误差。由于同位素内标浓度是已知的，可以根据信号响应的比值准确计算出分析物的浓度。

　　同位素标定定量法

　　当无法取得分析物的同位素标准品时，可以利用结构相同但同位素组成不同的衍生化试剂。如分析物和轻试剂反应，标准品与重试剂反应，将反应后的标准品加入反应后的样品溶液，则可进行如前所述的同位素内标定量。

　　同位素标定定量法也可进行样品间的相对定量，常用于蛋白质组学分析，主要包括质量差异标记和同整质量标记（Isobaric Tag）两种方法。前者代表方法为ICAT定量，后者代表方法为iTRAQ和TMT定量，它们都属于化学标记，也是蛋白质组学重最常用的定量方法。

　　化学标记法

　　Gygi等发展了同位素编码亲和标签（Isotope-Coded Affinity Tag，ICAT）。此试剂包含了可键合于半胱氨酸（Cysteine）的反应基团（Reaction Group），含不同同位素的定量标记链接（Linker）和含有生物素（Biotin）可做纯化的亲和基（Affinity Group）。此试剂定量标记链接上共有8个氢原子，轻的氢、重的氘同位素将造成具有8 Da质量差异的多肽对。

　　 ICAT定量时，两种细胞萃取出的蛋白质被标示不同同位素组成但结构相同的化学标记，水解后再利用Avidin（亲和素）将标记上的多肽纯化出来并进行质谱分析。经过串联质谱分析可鉴定多肽的序列以及所对应的蛋白质种类，在一级质谱上观察到每个多肽受到轻重同位素标记产生固定质量差距的信号对，此信号对可用来得到相同蛋白在不同细胞状态的相对表达量（Relative Expression）。

使用ICAT对蛋白质样品进行定性与定量分析

　　早期ICAT试剂有一些缺点，如标签分子量较大，结合多肽后也会产生CID解离碎片，使谱图变得复杂；其次试剂使用8个氢原子来做质量标签，会引起同位素效应，即轻或重标签标记的多肽在HPLC分离时，多肽对的色谱保留时间的不同造成定量上的误差。后来AB公司发展出第二代cICAT（Cleavable ICAT）试剂，它以可酸解的标记端来连接同位素标签和生物素，其基本实验流程与第一代相同，差异是在进行质谱分析前，必须先经过酸切的步骤，以分离生物素及被标定的多肽。这种同位素标签由碳原子（12C和13C）组成，在分子量上的差异相对较小，所以被12C和13C标记的多肽在HPLC分离时具有相同的保留时间，可降低同位素效应，增加定量准确性。

　　后来，AB和赛默飞公司又分别推出iTRAQ（Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation）和TMT（Tandem Mass Tags）试剂，主要用串联质谱完成定量，也是目前最常用的蛋白质组定量方法。它们包括4种~16种同位素的编码标签，可同时比较多个样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。

　　以iTRAQ四重标签试剂为例，它由3个化学基团组成，分别是反应基团、报告基团和平衡基团。反应基团特异与肽段的氨基（肽段的 N 端、赖氨酸的氨基）发生结合反应， 报告基团的质量数不同，分别为114、115、116、117，加上相应的平衡基团（分别为31、30、29、28）后，保持 iTRAQ 试剂总的质量数均为145 Da，因此称为同整资料标记（Isobaric Tag），同时保证不同标记的肽段在色谱中的保留时间相同。

　　由于是等质量的，被不同标记的肽段在一级图谱中表现为一个母离子峰，进一步碎裂时，平衡基团发生中性丢失，报告基团则会产生相应的不同质量数的报告离子，比较报告离子的丰度值，可以得到样本的相对丰度比。目前 iTRAQ 可以同时对 4 个或者 8 个样本进行标记与定量。

iTRAQ 8标签试剂定量流程

　　赛默飞的TMT原理类似，TMT试剂最多可采用11种稳定同位素标签，包括2-plex、6-plex、10-plex、11-plex，TMT Pro试剂包括16-plex、18-plex。根据反应化学，TMT试剂分为三类——胺反应性、半胱氨酸反应性和羰基反应性。

TMT pro 18-plex标签试剂定量流程

　　TMT试剂的结构设计。TMT试剂结构的功能区域包括高能碰撞解离（HCD）和电子转移解离（ETD）和CID（碰撞诱导解离）的MS/MS碎裂位点。胺反应性、半胱氨酸反应性和羰基反应性TMT试剂如（A）、（B）和（C）所示。

TMT试剂的结构设计

　　细胞培养中的氨基酸稳定同位素标记（Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture，SILAC）

　　SILAC是一种代谢标记法，可对体外培养细胞或细菌进行代谢标记，但尚难用以人类蛋白质组。其实验原理是：在细胞培养基中加入轻、中或重型稳定同位素标记的必需氨基酸（赖氨酸和精氨酸），通过细胞的正常代谢，使新合成的蛋白带上稳定同位素标签。然后等量混合各类型蛋白质，酶解后进行质谱分析。通过比较一级质谱图中同位素峰型的面积大小进行相对定量，同时二级谱图对肽段进行序列测定从而进行蛋白鉴定。该方法在实验早期就进行同位素标记，定量较为准确，但缺点是只能限定于细胞标记，无法应用于组织或体液。

SILAC定量法示意图

　　免标记定量法（Label-Free）

　　基于质谱标记定量蛋白质组学应用范围比较广泛，美中不足标记试剂成本和样本制备较为复杂，复杂样本中处理的重复精度受限。直接通过MS信号进行定量的技术（Label-Free Quantification，LFQ）就很好地解决了这个问题，Label-Free技术不需要昂贵的标记试剂，基本适合各种类型样本进行定量，也广泛应用于定量蛋白质组学的研究。当然，它没有稳定同位素标记法准确。

　　基于质谱无标记定量的蛋白质组学按照定量原理基本上可以分为两大类：一类是基于离子流色谱峰（Extracted Ion Current，XIC）定量的信号强度法，第二类是基于谱图计数法（Spectral Counting，SC）进行蛋白峰度的相对定量。

　　由于概念简单、周期快，谱图计数法吸引了很多关注，但低含量的蛋白质取得的MS/MS谱图数量少，定量准确性较差，谱图计数法比较适合于浓度高的蛋白质。

　　信号强度法能够更准确估计蛋白质的浓度差异，且不受串联质谱图总数的影响，但需要高分辨质谱来分辨质量相近的多肽，此外，数据处理流程相对复杂，计算速度慢。

总结

    在所有的分析手段中，质谱具有“3S+3A”的所有特征：高灵敏度Sensitivity、高选择性Selectivity、高速度Speed、高准确度Accuracy、可自动化Automation、广泛的可用性Application。分析检测手段，但凡满足“3S+3A”中的1-2条，就有存在的价值，而质谱是六项全能。质谱的通用性更是出类拔萃，宏观上我们知道所有物体的质量都可以用“秤”来称量，这要感谢牛顿祖师爷发现的万有引力。而在微观上测量各种粒子的质量，就要依靠质谱，质谱又被誉为“测量分子和原子的秤”。但质谱不仅仅是一台简单的“秤”，它可驱动带电离子飞行并将它们分离，所以用“飞扬的离子”来形容质谱也很有诗意。

    本文介绍了质谱中重要的液质联用技术，主要用于食品、环境、药物、生命科学、临床等领域。由于软电离的特性，一级质谱往往只有干净的分子离子峰，但由于各种形式串联质谱的出现，液质联用的各级谱图中呈现出丰富的结构信息，并可以用以结构鉴定、确证和定量。因此，质谱是让很多人痴迷的技术，它变幻无穷的技术组合，赋予人们探索未知世界的想象力，也交给人们定量已知物质的一把利刃。围绕质谱的创新永不停歇，新的离子源、新的质量分析器、新的数据算法不断出现，它们产生的一系列组合又打开了一扇扇应用之门，指引着人们更兴奋地探索新的方向（完）。