液质联用中的质谱——串联质谱篇（中）

　　本文举几例常见的串联质谱仪，篇幅较长分为上、中、下三篇。

　　线性离子阱LIT/FTICR和LIT/Orbitrap

　　QqQ和QTOF都是串联两个“离子束”型分析器，近年来还有一种趋势是串联两个离子捕获型分析器，线性离子阱LIT/FTICR是此类最早的类型，由于维护困难，近年来慢慢被LIT/Orbitrap所取代。离子在不同质量分析器间的传输，不是连续的离子束传输，而是先在LIT中累积，再以离子包的方式，用C-Trap传输到Orbitrap中。实验中，LIT和Orbitrap可以同时进行质量扫描，提升Duty Cycle和分析效率。

　　Orbitrap相对于FT-ICR的弱点是，Orbitrap在内部无法碎裂离子，无法在Orbitrap分析器中直接进行MSⁿ，而是等待前级传来的碎片离子MSn，再进行高分辨率分析。但Orbitrap除了维护简单，还有一些优势。两者都是记录像电流，放大后经FT变换，因此灵敏度与信噪比相近，差异在于分辨率。对于ICR，分辨能力反比于质荷比；对于Orbitrap，分辨能力反比于质荷比的平方根，因此随着质荷比增加，Orbitrap的分辨能力比ICR下降更为缓和。小于m/z 300，ICR分辨能力高；大于m/z 300，在相同的检测时间下，ICR分辨能力下降的幅度大于Orbitrap。超过m/z 4000后，ICR的分辨能力降到比Orbitrap更低。因此大分子分析中，Orbitrap更优。

ICR与Orbitrap的分辨能力与质量关系图。两种质量分析器分辨能力均随质荷比增加而下降，而Orbitrap下降的幅度较ICR缓和，在更高质荷比时分辨率优于ICR

　　四极杆/轨道阱（Q/Orbitrap）以及三重串联质谱仪

　　四极杆和Orbitrap串联时，主要利用设置于末端的高能碰撞解离（HCD）池执行HCD模式。HCD专指Orbitrap类仪器中离子在高能碰撞池或多级离子通道中的碎裂方式，相比于CID碎裂方式能获得低m/z的碎片离子，产生的碎片相对更多，谱图质量更高。Q/Orbitrap的最新型号如Orbitrap Exploris系列，体积紧凑可作为桌上型仪器。

Orbitrap Ascend Tribrid仪器示意图

　　Orbitrap还可同时结合四极杆和线性离子阱成为三重串联质谱仪，如最新型号Orbitrap Ascend Tribrid，平台的三重特性通过多种碎裂技术、多通路性（并行分析，即用一台分析仪隔离离子，同时用另外两台分析仪进行检测）和同步母离子选择 (SPS) 实现了功能扩展。这里的C-Trap 有前置多级离子通道，用于离子储存和MS2碎裂；还有后置多级离子通道。以蛋白质组学定量实验为例，图中所示绿、蓝、黄色的不同离子正在同步进行不同的运动。绿色离子先被选择后到Orbitrap后获得高分辨MS谱，然后经前置多级离子通道HCD碎裂后送入LTQ后续的检测器获得MS/MS，又到LTQ获得MS³，同时累积富集蓝色离子；接下来将绿色离子的MS³送入Orbitrap获得高分辨谱，同时将蓝色离子做HCD碎裂，然后重复前面绿色离子的过程。图中所示，当富集黄色离子时，绿色离子将完成高分辨MS³，蓝色离子的MS3正等待送入Orbitrap。

蛋白质组学定量实验：TMTpro SPS MS³方法

　　Ascend上还具有CID、 ETD, UVPD, PTCR 和MSⁿ

　　HCD 等多种解离模式（后文会专门介绍各种解离模式）。将三个质量分析器协同工作的模式，与不同的解离模式搭配，使Ascend Tribrid具有多种可以操控的组合模式。

　　2023年，赛默飞又推出了新型Orbitrap Astral质谱仪，它也是一个三重串联质谱仪，包括四极杆、Orbitrap、Astral三个质量分析器。Ascend中，LTQ的谱图采集速度大概是50Hz，而Astral可以达到200Hz（每秒采集200张MS/MS谱）；同时Astral可以获得8万分辨率的MS/MS谱，只是Astral无法如LTQ再进行MS³实验。未来，三个质量分析器还可以通过协同工作，产生更多的实验流程。

Orbitrap Astral示意图

　　离子淌度质谱

　　离子淌度（Ion Mobility）有时译为离子迁移，出现早期也被称气相电泳，可以独立使用，也可以配合质谱使用。最早的研究始于1950s，因其结构简单、快速、灵敏、小巧便携适于挥发物检测，在安检、化学武器、爆炸物与毒品检测、在线检测等领域，可独立使用，原理与TOF类似，但不需要高真空。离子淌度的核心原理是电场驱动下离子在气体阻尼环境中的迁移速率产生差异而分离。本文只介绍同质谱配合使用的离子淌度。

　　一种应用是安装在质谱仪的离子源与真空接口之间，使用气相差分离子淌度来分离共洗脱化合物、同分异构化合物以及隐藏在高背景噪声中的化合物。其代表是SCIEX的SelexION技术和赛默飞的FAIMS技术。

　　SCIEX的离子淌度差分质谱分离技术(Differential Mobility Spectrometry, DMS) 又叫差分离子淌度。SelexION DMS装置由两块平行金属电极（10×30mm，1mm间隔）构成，置于curtain （离子源帘气）和 orifice（采样锥）之间，在大气压条件下工作，结构简单耐用，拆装无需破坏质谱真空系统。分离电压 (SV) 垂直于输送气流的方向应用至整个离子传输通道，由于高电场和低电场离子淌度系数之间的差异，离子向壁迁移并离开飞行路径。 它们的轨迹通过称为补偿电压 (COV) 的平衡 DC 电压校正。DMS 技术记录在一定范围的 SV 振幅下校正特定离子的轨迹所需的 COV。 可以扫描 COV 以根据离子的差分淌度连续传递离子，或者将其设置为固定值以仅传递具有特定差分淌度的离子种类。

SelexION工作原理示意图

　　DMS通过降低化学噪声及预分离相似质量的离子，提高质量分析的质量和定量准确性。在 SV 和 COV 设置为零时允许无差别传输所有离子。DMS支持同时传输两种极性的离子，并根据它们的差分淌度常数分别进行分离。

　　FAIMS（High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry，高场非对称波形离子迁移谱）和SelexION类似，只是两电极由内部圆柱电极、外部环电极组成，离子在电场的驱动下绕过中心圆柱电极。工作时，离子在气流的携带下移动，在两电极上加上两组电压：周期不对称方波 DV 和补偿电压 CV。DV 是周期性的高/低电压交替。由于高/低电压所对应的迁移率不同，离子会呈现锯齿状轨迹，且每个周期都会有一小段垂直方向上的位移。在此基础之上，若叠加固定的补偿电压CV，则满足特定差分迁移率（高场下迁移率与低场下迁移率的差值，因此 FAIMS 也叫差分离子淌度）的离子能够平稳地飞过电场，其它离子则会撞到极板上，这就实现了离子选择。若随时间改变CV即可实现对不同离子的扫描，电压范围一般为-50V~10V。

赛默飞FAIMS Pro Duo高场非对称波形离子迁移谱

　　离子淌度的另一种应用是在质谱内部，强调为传统质谱增加新的分离维度，提升信噪比，并可分辨同分异构体、多电荷态。离子淌度质谱自Waters 2006年推出SYNAPT 开始，在很多高端QTOF质谱中配置，如安捷伦于2009年推出6540，布鲁克于2016年推出timsTOF。离子淌度装置的位置在离子传输Q0区或碰撞室Q2区，淌度分离是第一目标，后来从timsTOF开始发现有富集离子的作用，在和TOF的脉冲配合后有提升Duty Cycle的作用，即在TOF脉冲进样的间隔富集离子，在进样时把所有的离子送入TOF。由于四极杆Q1是连续流传输离子的，所以淌度装置在Q1前端Q0区和Q1后端Q2区都能发挥同样的作用（当然，如果不用淌度装置，用阱类装置也可以达到富集离子，提升Duty Cycle的效果）。

　　离子淌度使传统质谱除了按质量和电荷数之外，还可以根据离子的尺寸和形状分析样品，为研究人员提供了传统质谱所不能获取的特异性信息。该技术所获取的4维数据信息，包括色谱保留时间、质谱质荷比、淌度漂移时间、离子强度。通过软件能够对其中的任意二维或三维信息进行自由选取或可视化处理。

安捷伦6560离子淌度QTOF示意图

　　安捷伦2021年最新的6560C离子淌度QTOF的工作原理为：入口离子漏斗聚焦，进入捕集漏斗，累积一定量离子后，打开ion gate，向漂移管（约80cm长）注入离子。离子依次通过漂移管，进入出口离子漏斗，再次聚焦，进入后级Q1四极杆。使用安捷伦高分辨率多重性分解 (HRdm 2.0) 软件进行后处理，可实现高达 200 的全谱离子淌度分辨率。

　　沃特世有独特的各种“Wave“技术，用于Q0和碰撞室，如ScanWave，StepWave，Travelling-Wave行波（简称T-Wave）技术等，主要是为了提升传输效率。T-Wave技术用于QTOF碰撞室，在原有碰撞室气体的基础上加更多的气体，由于不同尺寸大小的离子碰撞截面积不同，阻力也不同，因此能把不同形态的离子分开，即离子淌度。沃特世在2006年推出高清质谱SYNAPT HDMS，目前最新型号为SYNAPT XS。

沃特世SYNAPT系列离子淌度QTOF示意图

　　首先离子在TRAP T-Wave中蓄积，然后被释放到IMS T-Wave中，完成离子分离。随后离子通过TRANSFER T-Wave 传输至质量分析器。其工作周期约几十毫秒。注意，IMS离子淌度分离发生在Q1后的碰撞池中。2015年，沃特世还推出了VION，和6560类似，淌度池在离子源和Q1之间的Q0区。

　　2019年沃特世发布了环形淌度 SELECT SERIES Cyclic IMS ，用紧凑型环形离子导向装置替代传统的线性离子淌度区域，可以控制离子进行一圈或多圈的淌度分离，淌度分辨率可从单圈的65提升到多圈的400，甚至有研究报道至100圈时可获得750的淌度分辨率。镀金电极阵列固定于PCB板上，多功能T-WAVE 阵列控制离子多种模式，除了可以根据选择做多圈的淌度分离后送入TOF，还可以从离子组合中选择并分离出某个离子，并以CID活化重新注入，进而可获得IMSn（n最多为5级）。

沃特世SELECT SERIES Cyclic IMS环形淌度质谱仪示意图

　　2016年，Bruker推出timsTOF，淌度分辨率从原来市场上的40 提升到 近200，关键技术是TIMS (Trapped Ion Mobility Spectrometry) 捕集离子淌度，其位置在Q1前。

TIMS原理示意图

　　气流携带离子进入逆向梯度电场（像一个加了坡度的跑步机），若气流速度与离子的迁移速率相等则离子相对于漂移管静止，即不同离子依其淌度差异，分布在不同电场强度的位置。离子截面越大，离子淌度越小，维持静止所需的电场强度越高，即稳定在高场区域。此时若逐渐降低电压，即实现扫描。若改变电场梯度分布还可选择性释放出单一淌度值的离子，即SA-TIMS (selected accumulation-TIMS)。其工作气压约0.2 ~ 0.5 KPa。传统的2米长的迁移管，分辨率约等于80左右；而只需要一个5厘米长的TIMS部件，由于流速可调，将流速增加至漂移距离约等于10米，R即可约等于180。

　　随后，布鲁克推出了双TIMS的timsTOF Pro和随后的系列，并和Matthias Mann合作发布Parallel Accumulation–Serial Fragmentation (PASEF) 平行累积连续碎裂技术。它使用了两组 TIMS，离子在第一个TIMS部分中进行累积，然后进入第二个TIMS完成淌度分离，分离后的离子继续MS/MS碎裂，随后重复该步骤。而在PASEF过程中，当第二个TIMS进行分离时，第一个TIMS也同时在平行地累积离子，这样可以实现近乎100％的离子利用率。对于蛋白质组学来说，大幅提升灵敏度和序列覆盖率；同时结合了离子淌度的4D分离技术，能够实现碰撞横截面（ CCS ）的分析，也在蛋白质组学的相关应用中发挥了巨大作用。

双TIMS支持的dia-PASEF® 增加组学鉴定可信度

接下来请见下篇：液质联用中的质谱：串联质谱（下）

目录：

前言：液质联用（LC-MS）简述

Chapter1、液质联用中的液相色谱

Chapter2、液质联用中的质谱

2.1离子源

2.2离子传输

2.3 质量分析器

2.4串联质谱（Tandem Mass Spectrometry，MS/MS）

2.5 检测器

2.6 真空系统

Chapter3、液质联用中的数据采集和分析