清华百人计划发表CRISPR新成果

　　CRISPR/Cas已成为强有力的基因组编辑技术，并已成功地应用于 许多生物，其中包括几个植物物种。然而，在植物中，基因组编辑试剂载体的传递仍然是一个挑战。最近，来自清华大学和中科院微生物研究所的研究人员，在 Nature子刊《Scientific Reports》发表的一项研究中，报道了一个基于病毒的引导RNA（gRNA）传递系统，用于CRISPR/Cas9介导的植物基因组编辑 （VIGE），可以用来精确地靶定基因组位置，并引发突变。

　　本文通讯作者是清华大学生命科学学院的刘玉乐教授。刘玉乐教授1988年毕业于南开大学，1992年在中科院微生物研究所获硕士学位，1997年， 获中科院微生物研究所与英国苏格兰作物研究所联合培养博士，曾在英国苏格兰作物研究所、美国德克萨斯大学奥斯丁分校、美国耶鲁大学做过访问学者、博士后和 Associate Research Scientist，2007年至今为清华大学教授，“百人计划”责任教授，博士生导师，国家杰出青年基金获得者。研究方向为植物免疫的信号传导与调控、 植物病毒病理的分子基础、植物细胞自噬、植物功能基因组。研究成果多次发表在Plant Physiology、PLoS Pathogens、Plant Cell、Molecular Plant、New Phytologist、Journal of Biological Chemistry、Developmental Cell等国际学术期刊。

　　基因组修饰是植物遗传学研究的核心和关键步骤，这可以通过随机和靶向（位点特异性）诱变完成。虽然目前有很多生成随机基因突变的工具，如通过诱变剂 的化学诱变、通过快中子辐照的物理诱变、γ射线或X射线，以及在植物中通过转座子或T-DNA的生物诱变，但是，我们很难将所需的突变与随机突变区分开 来。为了克服这种局限性，科学家们开发出三种方法，包括锌指核酸酶（ZFN）、TAL效应器核酸酶（TALENs）和CRISPR/Cas编辑系统，通过 在多种生物（包括植物）中诱导特定位置的DNA双链断裂，完成位点特异性诱变，这会刺激细胞的DNA修复机制，包括容易出错的非同源和末端连接（NHEJ）。

　　CRISPR/Cas DNA编辑系统，是最新开发的一种用于基因组工程的新方法。它基于细菌对抗入侵DNA病毒和/或质粒的II型CRISPR/Cas（CRISPR相关）免 疫系统。II型CRISPR/Cas系统利用整合到CRISPR位点的外源DNA片段，随后通过转录加工成CRISPR RNAs（crRNAs）。反过来，crRNAs退火以反式激活crRNAs（tracrRNA）和并产生向导RNA（gRNA），指导序列特异性切割并 通过Cas蛋白沉默外来入侵的DNA。在最近开发的CRISPR/Cas DNA编辑系统中，gRNA可以指导核酸内切酶Cas9靶来诱导特异位点的精密切割。CRISPR/Cas系统可在哺乳动物细胞和整个生物体中实现基因敲 除，如酵母、斑马鱼和线虫。后来，这种方法被迅速用于植物，在植物学研究中，它通过瞬态实验和转基因植物继续表现出其适用性。延伸阅读：中国农科院用CRISPR实现大豆基因组编辑。

　　CRISPR/Cas比ZFNs和TALENs更有利，因为它只需要一个单一的Cas9核酸酶，可以通过设计gRNA而编程，以指导靶特异性切割， 但它不需要精心设计以及耗时的单个DNA结合蛋白装配。有研究证明，CRISPR/Cas系统在植物中能够通过瞬态实验或转基因植物实现高效的基因编辑。 在大多数情况下，Cas9与gRNAs是通过农杆菌介导的T-DNA转化或物理手段传递到植物细胞的，如PEG介导的原生质体转化或愈伤组织的基因枪转 化。

　　双生病毒DNA复制可以提高基因打靶频率。最近，据报道，烟草花叶病毒（TRV）——一种在细胞质中复制的RNA病毒，可以将gRNAs传递到转基因的Cas9表达烟草中，以实现系统的基因组编辑，甚至可以在两个后代植株中被检测到。然而，在植物中还没有基于DNA病毒的基因组编辑传递系统。

　　白菜卷叶病毒（CaLCuV）是双生病毒家族中的菜豆金黄花叶病毒属，在细胞核中复制。它 通过两个独立的基因组编码七种蛋白。目前，科学家已将CaLCuV开发为一种病毒诱导的基因沉默（VIGS）和miRNA表达载体。CaLCuV可感染十 字花科和茄科中的许多宿主，延伸了其在植物生物技术中的应用。

　　病毒诱导的基因沉默（VIGS）被广泛应用于植物基因功能研究。然而，VIGS只能下调基因表达，在不同发育阶段其有效性有所差异。为了克服这些局限性，在这项研究中，研究人员利用一种DNA病毒，在植物中进行系统的基因敲除。病毒介导的基因敲除将没有这些局限性。

　　他们报道称，CaLCuV——一种双生病毒，能够在植物中传递gRNA和诱导系统性的基因突变。研究人员使用修改的CaLCuV载体完成了植物基因组编辑（VIGE），在表达Cas9的稳定转基因植物中表达gRNAs。

　　DNA测序在未接种叶子中证实了内源基因NbPDS3和NbIspH的VIGE，因为CaLCuV可以系统地感染植物。此外，在新发育的叶片中，NbPDS3和NbIspH的VIGE，可引起光漂白表型。这些结果表明，双生病毒为基础的VIGE，可能是植物基因组编辑的一个强大工具。