激光扫描共焦显微镜技术及应用（一）

样品要求：

1. 经荧光探剂标记(单标、双标、三标）

2.固定的或活的组织

3.固定的或活的贴壁培养细胞(Confocal专用小培养皿，盖玻片)

4.悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封

一. 组成

倒置或直立荧光显微镜、扫描头(照明针孔、探测针孔、荧光滤片系统、镜扫描系统和光电倍增管)、扫描头控制电路、计算机和图像输出设备

二. 原理

Confocal

利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像。

三. 激光扫描共焦显微镜的设计特点:

1. 点照明

2.具有照明pinhole和探测pinhole

3.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面

4.具有扫描系统—— 逐点扫描成像

5.具有多个（四个） 荧光通道，可同时探测多个被标记物

Leica TCS NT 的技术指标:

xy分辨率比传统显微镜小1.4x

传统显微镜: Rxy=0.61l/NA

Confocal: Rxy=0.4l/NA

2. 样品的最大厚度:大约 2mm(10X/0.2物镜)

取决于三点:

物镜的景深, 与NA成反比

Z轴的最大移动范围

激光的穿透力

3. 样品的最小光切厚度: 大约0.35 mm

取决于两点: 物镜的数值孔径NA

Z轴的最小移动步距: 40nm

Z轴的分辨率: 0.35 mm

4. 激光器

Kr/Ar激光器: 477nm, 488nm, 568nm, 647nm

Ar激光器(UV): 361nm

激光器的特点:

1) 方向性好: 激光基本眼直线传播

2) 单色性好 l=10-8nm

3) 高亮度: 激光方向性好,其在空间上的能量分布是高度集中的

4) 偏振性: 激光为平面偏振光, 光纤耦合

5. 四个荧光通道, 一个透射光通道, 即除了可同时采集

多标记荧光图像外还可以同时采集透射光图像,但透

射光图像为非共焦图像

四. 共焦显微镜的类型：

1. 点(慢)扫描共焦显微镜: 分辨率高, 图像清晰;
   

噪音低;

采集图像速度慢;

目镜中观察不到共焦图像;

2.线(狭缝)扫描共焦 显微镜(video rate): 分辨率低;

噪音高;

扫描速度快 240幅/秒;

目镜中可观察到共焦图像

3.Nipkov转盘式扫描共焦显微镜: 性能介于上述两者之间

功能:1.多荧光标记样品的图像采集

2.无损伤、连续光学切片，显微“CT”

3.真正的三维重组

4.假三维图的显示

5.可沿Z轴（xy平面）和Y轴（xz平面）方向进行光切

6.定量分析

7.xyt 、xzt、xyzt 和 xt 扫描—— 时间序列扫描

8.图像处理

9. 旋转扫描

10.区域扫描

11.光谱扫描