生物标志物biomarker检测技术进展（四）

全新的SMC单分子检测技术

虽然现有多项生物标志物检测技术已经丰富了人们对生物标志物的认识，获取了大量数据和经验，解决了很多生物学或医学问题，但如前文所述的诸多瓶颈仍限制了生物标志物的应用。尤其是对于疾病，特别是肿瘤的早期诊断或预防而言，在疾病的潜伏期或是发生早期，就能在血清/血浆这样容易获得且远离病灶的样本中发现生物标志物的存在十分必要。研究表明这些标志物的含量很可能低至每毫升亚皮克级。上述几乎所有的技术对于这一检测区间都显得无能为力。第二，据文献报道，在已知的约400,000种人类蛋白中，有大约75%，也就是300,000种被现有技术很难检测到。大量生物标志物处在现有技术的检测极限之下。第三，现有技术很多情况下受制于较低的灵敏度，仅能在疾病个体中测得某种生物标志物，而此时疾病可能已经进入实际发生阶段。在健康个体或是疾病风险的个体中尽管这些标志物含量极低，但很可能具备预测性作用，而现有技术无法有效利用这一点。第四，医学研究者在临床上获取了各种类型的体液样本，例如脑脊液、宫颈液、肺泡灌洗液、泪液、尿液等，这些体液样本中经常生物标志物含量极低，但却具备特定领域的独特研究价值，而其中蕴含的宝贵生物学信息常被现有技术忽略。因此，人们亟需开发更为灵敏且特异的生物标志物检测技术来更好地满足基础医学或转化医学的研究需要。

图5. 单分子检测技术原理

新技术的诞生为这些研究需求的实现提供了重要的机会。单分子检测技术（Single Molecule Counting, SMC），在抗体依赖的蛋白生物标志物检测方面产生了质的变化。单分子检测主流的检测技术以Erenna等单分子检测平台为代表（也被称为Singulex），基本原理在于利用毛细管进行荧光素标记分子的上样，并以激光聚焦的方式进行单个分子的激发检测。当荧光素标记分子通过高能量的激光焦点时，单个蛋白分子偶联的荧光素所发射的光闪烁信号被检测器测得。光闪烁信号的次数和强度与分子浓度呈正相关性，从而能建立标准曲线。通过对一定时间之内光闪烁信号进行统计，可以对溶液浓度进行定量检测（图5）。这项技术的创始存在一定争议，有多位学者在同一时期利用单分子检测技术对不同分子进行了单分子检测，并取得了成功。其中代表性的工作包括：1996年，Chen等学者成功进行了藻红蛋白的单分子检测；同一年，Craig等学者利用单分子检测技术检测了碱性磷酸酶；1998年，Fister等学者进行了罗丹明6G分子的单分子检测。^[3-5]

针对蛋白生物标志物的检测，单分子免疫检测试剂盒仍采用比较典型的双抗免疫夹心法。与普通ELISA均匀照射96孔板板底的检测方式不同，SMC技术试剂盒会将形成双抗免疫夹心复合物的分子进行解离，然后利用单分子检测方法对荧光素标记的二抗进行测定（图6）。这项技术最大的优势在于灵敏度显著提高，在实际工作中经常能达到每毫升百分之几皮克的灵敏度（图7），大致相当于普通ELISA 1000倍左右的水平。

图6. 单分子免疫检测的实验流程

图7. 抗体依赖的生物标志物检测技术灵敏度对比（引自参考文献）

相对于前面所综述的传统检测技术，SMC单分子检测技术的应用正处于高速发展阶段。尽管行业内普遍看好，但这项技术为生物标志物检测带来的变革仍需时间来证明。该技术在肌钙蛋白（Troponin I, cTnI）检测案例中已经展现出非常重要的价值。与传统技术仅能检测心脏疾病个体的cTnI因子不同，这项技术在健康个体中就可测得痕量的cTnI因子。长达12年的研究结果展示了令人惊讶的发现（图8^[6]），健康个体的本底cTnI因子与未来心脏病的累积发病率呈反比。在另一项高水平的研究报告中，亨廷顿舞蹈病的未发病个体（突变基因携带者）脑脊液中微量的突变型mHTT蛋白可被稳定测得，为亨廷顿舞蹈病的诊断和治疗提供了全新的方案^[8]。

图8. 单分子检测技术对健康个体cTnI的检测可预测心脏病累积发病率