实验材料 母板
试剂、试剂盒 细菌细胞中的标记LB 培养基氨苄青霉素乙醇Super 肉汤培养基 甘油96孔碱裂液T low E 缓冲液10 X PCR 缓冲液 20 X SSC琥拍酸酐
仪器、耗材 96深孔板和V 形塑料细胞培养皿水平微量培养板离心96孔多位点复制针1 加仑储存袋多微孔的带层带孔的振荡器用于深孔板消毒密封的 96 孔板薄 96孔 PCR 孔板和密封的 PCR 板 96 孔加热循环控制装置微滴定率冲洗板培养箱智能玻片打印机
实验步骤
1.密封的低密度标准培养基中 37°C 培养过夜（大部分卖方提供低密度培养基）。如果已经高密度培养过可以省去这个步骤，否则会降低活性。
2.准备重复的 96 孔板分别标记，每孔中加入 100ul 的含 100 ul/ml 氨苄的培养基。（通过氨苄抗性检查 EST 克隆）标记孔板以方便辨认。
为保存孔板，一种工作孔板被用做培养基来源（第 2~5 步）。
3.在水平微量培养板离心机上 167 g 离心 2 min, 弃上清。
4.将 96 孔多位点复制针浸入纯乙醇溶液中，火烧。冷却后挑克隆于装有 LB 的孔板中，可重复操作确保接种。
5.将孔板置于含湿润带层的 1 加仑储存袋中 37°C 培养过夜。
6.在 96 孔板中加人 Iml 含 lOOul/ml 氨节的 Super Broth 中。用多位点复制针接种到新鲜的 LB 中，盖上盖后在深孔板振荡器上 200r/min 37°C 摇 24 h。
7.每孔中加 50ul 45% 灭菌甘油，-80°C 保存。
8.预温裂解液（来自裂解试剂盒）于 37°C 直到 SDS 溶解。加入 1ml RNase 于 IOOml 重悬液中，4°C 保存。
9.每孔中加 350^1100% 变性乙醇（来自试剂盒）。盖上滤纸，小心操作以防孔板装得太满。
10.1500 g 离心 7 min。迅速倒置弃上清后换上一张干净的滤纸。要迅速，否则沉淀将浮起或移动。
11.每孔加入 100ul 含 RNase 的重悬液重悬。全部重悬后加入100ul 裂解液，轻轻混匀避免振荡染色体 DNA。
12.每孔加入 100ul 沉淀液，充分混匀后加 100ul 中和液。混勻后转移到试剂盒提供的孔板里。
13.1500 名离心 12 min。弃上清后加乙醇洗后滤出。用滤纸吸干多余的乙醇。
14.每孔中加入 500ul 70% 乙醇。迅速倒掉，吸掉多余的乙醇。将孔板放置于一干净容器中，盖上干净滤纸过夜。
15.重悬 DNA 用 200ul T low 溶液。密封让其在 4°C 溶解至少 2d 才能用。质粒保存温度为-20°C。
16.扩增 96 孔板中的 DNA，以下是 PCR 反应试剂：
17.标记薄％ 孔 PCR 板，标记供体和受体板在板的 Al 孔处以确定方向。
18.每孔中加 100 ul PCR 反应混合试剂。轻轻加人确定孔底没有气泡后，每孔中加入 Ijul 纯化的 EST 质粒模板。确定模板都加人到了 PCR 反应试剂中。
19.以下是循环体系：
20.用 2% 的琼脂糖胶电泳 2ul 的 PCR 产物，选用适当大小的分子标记（支持方案 1)。如果扩增产物已经被证实了，每个孔板只要分析一排就够了。
21.选取孔板中一排中的一个孔，用荧光测定法分析 1ul 扩增产物（支持方案 2)。
22.每孔加 200ul 乙醇/乙酸盐溶液于 96 孔 V 形底板。再每孔中加 100ul PCR 产物进行纯化，用移液枪混勻 4 次。
23.于-80°C 培养 lh过夜，充分溶化。
24.4°C下2600 g 离心40 min。弃上清，留 10~20u1 在底部避免吸到沉淀。
25.用20ul 70% 乙醇洗沉淀，4℃下2600g 离心 40min。吸去上清让其在一封闭容器中风干过夜。不要用快速蒸发器。
26.每孔中加40 ul 3 X SSC, 小心密封孔板。将孔板置于加热储存袋中。将加热储存袋放置在 65°C 培养箱中 2 h，之后让其自然冷却。
27.选取孔板中一排中的一个孔分析 1 ul 提纯的重悬PCR产物用2% 的琼脂糖胶跑胶(支持方案1)。查看跑胶条带。产物于一20°C保存。
28.在转移PCR产物到玻片前，详细参看打印笔的说明。
29.用多聚L-赖氨酸包被玻片（支持方案3)。
30.将溶解的纯化 PCR 产物 167 g离心2 min。转移5~10ul PCR产物于孔板中，这将作为打印的原液。
四列直插式打印笔能产生连贯的小点，液体体积要少，打印笔深不能超过 1mm。
31.带有DNA溶液和连续沉积溶液的笔在玻片上打点。用重复的打印检查玻片上点的大小和位置。同样证实了笔能携带溶液并打点，这样简单的负荷物能产生出我们所需要的玻片。
32.如果一个或者更多的笔没有在要求的水平，重新清洗或者换另一个笔重新检测。如果所有的笔都显示了，进行全部的印记。
33.印记最后，从印记仪上取下片子，在片子边缘用玻璃刀标明编号和印记标记。并用玻璃刀刻线来标明这片子在第一块片子上的印记区域。将片子放到清洁的玻片盒，可存放一周。
34.将片子印记的一面向上放置，在一个约 24 cm X 34 cm X 5 cm Pyrex baking 皿中，盖上塑料盖。将片子用 450mJ 强度的紫外线照射。将片子转移到不锈钢架子上，并将架子置于小的玻璃容器中。
35.溶解 6.Og 琥珀酸酐于 325 ml 1-甲基-2-吡咯酮在玻璃容器中，用玻璃棒搅拌加速溶解。
注意：无菌手套应预热，并且操作；1-甲基-2-吡咯酮（一种致癌剂）应在化学防护通风橱内进行。
36.加 25 ml lmol/L 硼酸钠缓冲液到烧杯中。搅拌混合几秒钟，然后迅速倾倒到放片子^玻璃容器中。将玻璃容器放到摇床，70~90r/min 摇 20 min。
37.浸片子到沸水中。立即关掉加热器，让片子在热水中孵育 2 mm。将片子转移到 1L 盛有无水乙醇的玻璃容器中孵育 4 min。
38.转移片子到水平离心机中，167 g 离心 3 min。转移片子到一个清洁的片子盒，竖直放置过夜，准备杂交。