甲基化——肿瘤检测治疗的又一靶标？

在测序和相关技术不断进步的今天，研究人员不仅能够获得DNA、RNA的碱基序列，更能够获得碱基修饰的复杂信息。目前已经证明DNA甲基化能够导至的肿瘤产生，而Ribomed、基准医疗和鹍远基因等公司作为该领域的先行者，已经开发出相关产品。RNA作为中心法则的下游分子，也有多种多样的修饰，特别是m6A甲基化目前也愈发受到关注。今天，小编就和大家梳理一下甲基化修饰与检测的来龙去脉。

一、什么是甲基化？

甲基化是指碱基上引入甲基的过程，DNA，RNA均存在甲基化现象。

DNA甲基化是指DNA序列上特定的碱基在DNA甲基转移酶的催化作用下，使得碱基获得甲基的过程。这种DNA甲基化修饰可以发生在胞嘧啶、腺嘌呤及鸟嘌呤。一般研究中所涉及的DNA甲基化主要是指CpG岛上胞嘧啶的甲基化过程，其产物为5-甲基胞嘧啶（5mC）。CpG岛（CpG island）是指基因组某些区域CpG序列的密度比平均密度高10~20倍，CpG岛的功能是通过甲基化与去甲基化调控下游基因的表达。如果CpG岛发生高甲基化，基因表达就会被抑制。肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态变化，一般是总体甲基化水平降低与局部甲基化水平升高，指示肿瘤相关蛋白的失控表达。因此针对相关DNA序列甲基化检测可以帮助肿瘤的早期筛查。

图1 DNA甲基化

RNA甲基化成因则更为复杂，m6A（N6-methyladenosine，6-甲基腺嘌呤）是真核生物mRNA内部序列中最常见的一种甲基化修饰，同时可以功能性的调节真核生物的转录组从而影响mRNA的剪接、出核、定位、翻译和稳定性。m6A-RNA出现在多种重要的细胞生命过程中，意味着mRNA甲基化参与了多种生物学过程，如干细胞分化、生物节律等，同时也参与了多种疾病的发生，包括肿瘤、肥胖和不育等。

图2 RNA甲基化

二、甲基化的生理功能

正常情况下，DNA和RNA甲基化都具有正常的生理功能。

5mC-DNA甲基化能够调节基因表达水平，例如通过调节DNA对应不同蛋白的表达调节胚胎发育，器官形成等。

m6A-RNA的功能则更为多样，在多个实验中观察到剪接的外显子和内含子显着富集了m6A峰，表明m6A与mRNA的选择性剪接之间的内在联系。目前推测，m6A对RNA剪接的作用可能是由于甲基化的发生会干扰剪接因子和mRNA之间的结合和相互作用，而m6A簇出现的位置可能恰好为某些RNA结合蛋白的结合位点。

除此之外，m6A还能够调控mRNA翻译，大多数m6A修饰发生在外显子，m6A在剪接后仍保留在成熟的mRNA中，因此，m6A也可以影响含m6A的mRNA的翻译。但是m6A对蛋白质翻译的影响似乎在不同的mRNA中是不同的（可能上调，可能下调）。m6A与miRNA结合位点之间的存在着很强的相关性。已有相关证据证明了m6A影响microRNA前体的剪接加工：m6A在转录本上的存在会影响选择性剪接，这种标记的核Readers蛋白能够介导核转录本的处理。另外，m6A也影响了mRNA的稳定性和出核效率。

三、涉足DNA甲基化检测的企业

由于DNA甲基化的机制和与肿瘤关系更为明确，因此DNA甲基化更早进入产业化并推出了一系列产品。Ribomed、基准医疗和鹍远基因作为这一领域的代表企业均推出了相关服务和产品。

1、Ribomed

Ribomed开发了专有的检测技术CAPS检测DNA甲基化，其灵敏度更高，能够检测较小片段DNA（小于50 bp），这些特性使得其技术非常适合液体活检和切片检查。其开发的产品GliomaSTRAT，能够通过甲基化检测分析和确定神经胶质瘤亚型。

2、基准医疗

基准医疗基于自主研发甲基化建库技术AnchorIRIS和配套AnchorMonarch分析流程，提供靶向DNA甲基化高通量测序服务，可实现对组织样本和血液样本进行DNA甲基化测序，全面分析肿瘤发生、发展中的甲基化变化。该流程可以对新鲜组织，外周血，石蜡组织进行检测。

图3 基准医疗甲基化检测技术（公司官网）

3、鹍远基因

鹍远基因则开发了基于高通量测序技术的无创ctDNA甲基化检测项目-ColonES。该产品可用于人群结直肠癌、结直肠进展期腺瘤（癌前病变）的检测，进展期腺瘤检出率大于90%，早期腺癌检出率大于95%。

图4 常乐思检测优势（公司官网）

四、RNA甲基化检测和应用的挑战性

RNA甲基化研究时间较DNA甲基化较晚，且机制更为复杂，目前尚无应用于临床的产品。我们认为进行RNA甲基化应用的挑战主要来源于以下几个方面：

（1）成因更为复杂：m6A甲基化也受甲基转移酶和去甲基酶的调控但其调控机制却远比DNA甲基化复杂得多，因此有许多内容未研究清楚。

图5 甲基化与肿瘤关系

m6A 甲基化与肿瘤研究进展, 遗传, 40(12), 2018, 1055

在一定情况下，m6A高甲基化可能指示肿瘤的产生。在早期的基础研究中，发现m6A甲基化参与了脊椎动物的造血干细胞的分化过程，这提示m6A甲基化很可能与血液系统肿瘤的发生发展有着密切联系。如METTL3过表达导至甲基化水平上升会促进肝细胞癌(HCC)的增殖和迁移，而降低 METTL3则会抑制细胞的生长和转移。

而在另一些情况中，m6A低甲基化才是肿瘤的指征。如在宫颈鳞状细胞癌患者的肿瘤组织中FTO表达显著升高，使得并发现这些患者对放化疗产生了耐受。

总体上讲，m6A通过调节mRNA表达水平调控肿瘤，在多种肿瘤中均已发现，但是对应关系不同，且机制复杂，在单一原因确定的肿瘤中可以作为潜在生物标志物，作为治疗手段，还需要更多研究数据支持。

（2）检测操作更为繁琐：相比于DNA甲基化可以在处理后直接进行PCR，RNA甲基化需要更为复杂的操作。利用甲基化RNA免疫共沉淀结合高通量测序技术，可以对RNA转录后甲基化修饰图谱进行全面研究，是表观转录组学研究的关键技术。其中关键是利用m6A抗体识别沉淀m6A-RNA序列，具体流程如下图所示：（1）将待测样本分离提取获得RNA序列；（2）打碎RNA获得碎片；（3）通过抗体捕获含有m6A的RNA片段；（4）扩增测序，获得RNA甲基化图谱。

图6 m6A甲基化检测流程

（3）RNA甲基化抑制剂研究较少：在检测之外，也有一些抑制剂研发工作开展，例如何川课题组利用从恶性胶质瘤病人中分离到的肿瘤细胞，阐述了甲基化酶METTL3，METTL14以及去甲基化酶FTO的抑制剂甲氯芬那酸在该肿瘤中的作用。用FTO抑制剂氯芬那酸处理细胞，提高RNA甲基化水平，抑癌效果明显。实验结果展示了m6A可能作为潜在药物治疗靶点。但目前研究力度不足，需要更多基础研究获得抑制剂化合物库进行机制研究和相关实验。

结语

DNA甲基化和RNA甲基化广泛存在于生命过程中，并参与了多种疾病特别是肿瘤的产生。其中DNA甲基化成因较为清晰，调控通路较为简单，已经成为肿瘤早期检查的重要生物标志物。而RNA甲基化虽然也参与了肿瘤发生发展过程，但是这一过程原因不同且成因复杂，尚不能作为统一治疗靶点。不过随着测序方法的进步，目前对于RNA甲基化的检测变得成熟简便，非常利于早起诊断和预后评估，我们认为这一过程的难点不在于数据的获得，而在于数据的深度分析。如何将获得的RNA甲基化数据与具体疾病的种类和进程对应起来，并提供类似于DNA甲基化的诊断参考，需要更大量样本的积累、也需要更多的基础研究支持、更需要临床数据分析的进步。