一、超薄冰冻切片的组织固定1.用干净的玻璃器皿或者一次性器皿配制固定剂 2.用新鲜配制的固定剂 3.2%~4% 的多聚甲醛和0.2% 戊二醛固定组织。戊二醛对于确保良好的超微结构是必要的。然而由于固定剂的交联特性,更高浓度(>0.5%) 则严重阻碍探针的穿透。因此,对于要用于研究的毎个样本,必须在超微结构保持和探针穿透性之间找到平衡点。 二、固定和样本制备小块组织采用浸泡固定。对于大的组织,如大鼠的脑,建议用灌注固定法。 1.过浸泡固定小块组织,4℃ 过夜。 2.Imol/L 磷酸盐缓冲液洗涤组织 2 次,每次 10 min。 3.用含有 0.15% 甘氨酸的 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液洗涤 2 次,每次 10 min。用含 2.3mol/L 的蔗糖 PBS 液浸泡组织至少 4 h,在浸泡时持续滚动小管子。 三、标本制备在切片前将组织块固定在标本支持物上;我们一般用铜钉固定。 1.用砂纸将钉子表面打粗糙。 2.洗涤钉子以去除小的金属碎片。 3.用 70% 乙醇洗涤钉子并用吸水纸干燥。 4.从蔗糖溶液中取出组织并用解剖显微镜将组织定位于钉子上。. 用吸水纸吸去过多蔗糖。 5.用干净的镊子把带样本的钉子放入液氮。 6.在液氮中储存样本直至使用 四、切片1.把组织样本从液氮罐转移至超薄切片机时,应确保没有融化。 2.超薄冰冻切片的理想温度为 100~120℃。 3.用干刀完成切片。 4.常做一个厚切片(500nm) 用来定位组织以及检查固定效果。这种厚切片能用 1% 甲苯胺蓝溶液染色。 5.细修剪标本边缘能改善超薄切片质量。可用剃须刀片或者玻璃刀完成。 6.对于薄切片(40~80nm),建议使用金刚石刀。 7.用接种环把切片从刀片上分离下来。这种接种环是一个 I5 cm 的塑料把手接了一个小金属套圈(直径 2 mm),金属套圈充满 2.3md/L 蔗糖或是蔗糖/甲基纤维素混合液。 8.用接种环收集切片后,让它们短暂解冻,并立即转移到筛网上。 9.用蔗糖/甲基纤维素混合液收集切片有两个优点,一是形态结构保持得更好更完整,二是筛网在冰箱中至少能储存 3 个月。 10.用透明塑料包被或碳包被的镍网;铜网在处理过程中会氧化,形成肮脏的沉淀,从而干扰电镜成像。 五、电镜原位杂交步骤将筛网(切片面朝下)放到含有 2% 明胶溶液的带盖培养皿上,在电热板上 (37℃) 放置 5 min,然后在 37℃ 孵箱内放置 20 min。 以下步骤都在小滴液体中完成。将小滴试剂(探针和抗体溶液用 5~10ul, 洗涤用 100ul) 点在封口膜蜡上,把筛网切片面朝下放在小滴上。 该方法选用了蛋白 A-金交联物。因为蛋白 A 与兔 IgG 的亲和力高,而与羊 IgG 的亲和力低,抗地高辛抗体多为山羊抗体,所以采用兔抗山羊二抗作信号放大的中介。 1.于 0.15% 甘氨酸的 PBS 温育 2 次,每次 5 min。 2.用 2XSSC 温育 2 次,每次 5 min。 3.在无探针的杂交缓冲液中预杂交 20 min。 4.加 O.Ig 探针液到 10ul 杂交混合液。 5.杂交筛网放入一个密闭容器中,同时放入湿滤纸以防杂交缓冲液蒸发,于 50C 置 3 h。 6.用 2XSSC 温育 Imin。 7.用 50% 甲酰胺和 2XSSC 混合液洗涤 2 次,每次 5 min。 8.在密闭和湿化的容器中,于 50°C 用 50% 甲酰胺/2XSSC 混合液严格洗涤 3 次, 每次 20 min。 9.用 2XSSC 洗涤 2 次,每次 5 min。 10.用含 I%BSA 的 PBS 洗涤 3 次,每次 5 min。 11.用含有 1% 鱼明胶的 PBS 洗涤 lOmin。 12.在山羊抗地高辛抗体(1:100 稀释于含 1% 鱼明胶的 PBS) 中室温下温育 Ih 或者 4C 过夜。 13.用含有 1% 鱼明胶的 PBS 洗涤 5 min。 14.用含有 1%BSA 的 PBS 洗涤 3 次,每次 10 min。 15.用含有 1% 鱼明胶的 PBS 洗涤 5 min。 16.在兔抗羊抗体(1:100 稀释于含 1% 鱼明胶的 PBS) 中温育 30 min。 17.用含有 1% 鱼明胶的 PBS 洗涤 5 min。 18.用含有 1%BSA 的 PBS 洗涤 3 次,每次 10 min。 19.在蛋白 A-胶体金交联物(稀释于 1%BSA 的 PBS,稀释比例依据使用说明)中温育 20 min。 20.PBS 洗涤 3 次,每次 15 min。 21.在含 1% 戊二醛的 PBS 中固定 10 min。 22.PBS 洗涤 5 min。 23.蒸馏水洗涤 5 次,每次 Imin。 24.在 2% 乙酸双氧铀液中温育 5 min。 25.用乙酸双氧铀/甲基纤维素洗涤 2 次,每次 Is。 26.将切片包埋于乙酸双氧铀/甲基纤维素中,置冰上 10 min。 27.用接种环从甲基纤维素液体小滴上移去筛网。 28.用滤纸去除过多的甲基纤维素,将筛网留在接种环上并让它风干 30 min。 29.转移筛网到筛网盒中 六、免疫细胞化学电镜原位杂交(EM-ISH) 与免疫细胞化学组合十分方便,在上述第 22 步后,接用以下方法: 1.用含有 0.15% 甘氨酸的 PBS 洗涤 3 次,每次小于 10 min。 2.用含 1% 鱼明胶和 I%BSA 的 PBS 洗涤 5 min。 3.与抗体(兔抗,稀释于 1% 鱼明胶和 1%BSA 的 PBS) 温育 45 min。 4.用含 I%BSA 的 PBS 洗涤 5 次,每次 Imin。 5.与蛋白 A-胶体金交联物(稀释于 1%BSA 的 PBS) 温育 20 min,可采用不同大小的金比较 ISH 信号的显示。 6.下接电镜原位杂交方法的第 20 步。 七、结果以往的研究已经显示,在软体动物椎实螺,能合成卵生激素(ELH) 的神经元的轴突内含有大量编码 ELH 的 mRNAVanMinnen1994)。我们用 EM-ISH 研究这些编码神经肽的 mRNA 的超微结构定位。首先,我们研究了 ELH 转录物在合成 ELH 神经元胞体内的定位。正如所料,发现它们主要与粗面内质网膜相关(图 3-2A)。其他细胞器中(如线粒体、高尔基体、分泌囊泡)则没有显示 ELH 转录物的存在,这一点可以从图 3-4 中观察到,上述细胞器并未出现 ISH 信号(小金颗粒)和 ELH 免疫反应性物质(大金颗粒)的共定位。然后,我们研究了 ELH 转录物在神经元轴突内的精确定位,发现它们主要位于轴浆中(图 3-3), 在含有 ELH 的核致密囊泡中则没有其转录物的存在,这一点与以前的报道相符(Dirks1996)。 在实验中,我们主要观察了编码 ELHmRNA 的超微结构定位,同时也发现山羊抗地高辛抗血清能与含有 ELH 的核致密囊泡交叉反应。为了避免这一问题,我们使用了鼠抗地高辛单克隆抗体(步骤 12), 然后在第 16 步用兔抗鼠抗体来替代原来使用的兔抗羊抗体。以上数据进一步说明做 ISH 时设立正确对照实验的必要性。
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