病毒的超低温保存方法

大多数微生物可用超低温保存，超低温保存法是适用范围最广的微生物保存法。需要复杂营养的微生物种，如用其他的贮存方法不能保持其活力(如植物的病原性真菌)，通常可用超低温的方法保存(ATCC 1983;Halliday，Baker 1985)。此法是将冻存在小管或安瓿里的细胞以较慢的冷冻速率(1℃/分钟)冷冻，直至—150℃，再将这些小管贮存在—150～-196℃的液氮中。

超低温的冷冻保护剂不同于冻干法所用的冷冻剂。ATCC 常用一种由甘油(10%)、二甲亚砜(5%)和培养液制成的混合剂保存多数的细胞株。这些化学试剂进入细胞内可避免内膜的冷冻损伤。 贮存在低温容器内的细胞复苏时必须小心操作。当小管被加热时，所形成的冰晶会将细胞杀死，正确操作就可避免这种事故。只要迅速将样品解冻就能减少活力的丢失，做法是：将封口的小管迅速放入37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打开管口，将内容物移入培养基。

超低温保藏的微生物必须始终贮存在温度非常低的环境中，因此需要液氮罐。在长期贮存的过程中必须经常注意补充液氮。这种贮存方式比冻干法需要更多的经费，包括为了维持贮存温度所必要的劳动力和液氮等。

2.2 材料

病毒超低温保存所需材料有：热收缩塑料管(Nunc Cryoflex)，液氮罐，防护手套和面罩，永久性记号笔，气体喷灯，装液氮的保温瓶。

2.3 方法

(1)剪一段两端各超出冷冻管长度2cm 的热收缩塑料管。

(2)将含有澄清病毒悬液(组织培养的上清培养基，或组织培养基内的细胞溶解产物均可)冰浴几分钟，用灭菌移液管将0.2ml 冰浴过的上清悬液分装到冷冻管内，并将盖子拧紧。

(3)将有病毒的冷冻管放入热收缩塑料管中部，插入正确的标签。

(4)用喷灯小心加热热收缩塑料管，并使之包住冷冻管。注意不要用太高的温度加热热收缩塑料管。

(5)再小心加热热收缩塑料管的两端，用大号镊子夹紧管的端口至完全密封。

(6)将密封好的冷冻管快速在装有液氮的保温瓶中冷冻(操作时要求戴面罩和手套)。

(7)将冷冻过的冷冻管放入液氮罐中的格子内，同时记录样品的详细的存放位置、实验编号和存放日期等。

(8)需要用时，迅速从液氮罐内取出所需样品，并投入37℃水浴箱中解冻后，用解剖刀片在冷冻管的硅化垫圈处切开热收缩塑料管。拧开冷冻管的盖子时不需要除去热收缩塑料管。